猪皮肤撕脱伤CD18的表达与组织继发性坏死的研究(2)
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1.3 组织中CD18mRNA的表达：采用RT-PCR 法检测组织标本中CD18mRNA的表达，用 Trizol 试剂(Gibco-BRL公司)分别提取实验组和对照组组织标本中的总 RNA，用随机引物将其反转录成 cDNA 后进行 PCR 扩增，并以β-Actin为内对照。其中扩增CD18基因的上游引物为5' TTTAgAAgAACAACCCgTgC 3'；下游引物为：5' TgTTgATgCTggACgTgCAC 3'；PCR 条件为：94℃30 s，55℃60 s，72℃60 s，30个循环。反转录按照试剂盒(Promega公司)提供的说明书进行，其中CD18的扩增片断为500bp，β-Actin的扩增片断为250bp, 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，用UVP凝胶成像系统进行检测，并用Labworks软件对各阳性条带的密度进行测定。利用PCR胶回收试剂盒(上海华舜生物技术公司)将PCR产物从凝胶上收回，进一步亚克隆至PMD18-T载体，经转化JM109感受态细胞、筛选、小量制备质粒DNA后，用Sanger双脱氧链终止法及测序试剂盒(Amer-sham)进行序列测定。
1.4 组织中MPO活性测定：取撕脱组织0.1g，加入0.5%溴代十六烷基三甲胺(Sigma公司)溶液2ml，用匀浆机(德国ART公司)匀浆。超声细胞粉碎仪(英国SANYO MSE公司)，(10s、3次)粉碎细胞及亚细胞成分。0～4℃，40000g离心15min。取上清0.1ml加反应液2.9ml(磷酸邻联茴香胺16.7mg，50mmol/LPBS液10ml，蒸馏水90ml，加入30%过氧化氢，使最终浓度为0.0005%)，分光光度计(HITACHI公司)460μm波长下立即进行2min扫描。以第30s至90s 1min时间内吸光度(OD值)的变化代表酶活力的改变。根据下列公式计算MPO活性单位(25°C下，每分钟分解1μmolH2O2的MPO的量为1个MPO活性单位)，以反映组织中中性粒细胞的浸润数量。MPO活性单位(×103U)/kg=(ΔA460/min)÷(11 ......
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