瘦素对脂肪细胞的直接调节作用(2)
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1.1材料：无内分泌及代谢性疾病的成人上腹部皮下脂肪组织，重组人瘦素(Pepro TechUSA)，胶原酶IV(Gibco USA)，转铁蛋白、生物素、泛酸钙、胰岛素(Sigma USA)，脂肪酸和甘油试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)等。
1.2 培养液的配制：①培养液a：DMEM/F12(1∶1)混合培养液(含10%FBS、33μmol/L生物素、17μmol/L泛酸盐、10万IU/L青霉素和100mg/L链霉素)；②培养液b：DMEM/F12(1∶1)混合培养液(含33μmol/L生物素、17μmol/L泛酸盐、10万IU/L青霉素和100mg/L链霉素,5mg/L 胰岛素、10mg/L转铁蛋白、10μg/L bFGF)
1.3 人前脂肪细胞培养：常规培养人前脂肪细胞：切取人上腹部皮下脂肪组织，DMEM培养液(含100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素)浸泡脂肪组织10min，剔除肉眼可见的血管和筋膜等其他组织；Hank’s液(含100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素)冲洗3遍后移入无菌的三角烧瓶，眼科剪剪成直径约1mm的小组织块，加入0.2%胶原酶IV 37℃水浴消化10min，含10%FCS的DMEM培养液终止消化。100目、200目不锈钢筛网先后过滤，取细胞悬液，离心(1 700rpm 10min)后弃上清；加入0.16mol/L NH4Cl作用10min，Hank’s液(含100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素)洗涤2次后离心(1 700rpm10min)，弃上清。培养液a悬浮细胞，按1×105个/ml浓度接种于12孔板，置37℃、5%CO2培养。每日观察，每2天换液一次。
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1.4 前脂肪细胞向脂肪细胞的诱导
1.4.1脂肪细胞诱导：参考目前常用诱导方法[6-7]，待前脂肪细胞生长融合后，PBS洗涤细胞2次，用无血清的培养液b于37℃、5%CO2诱导培养。每天观察，每2天换液一次。诱导培养一周后行下一步实验。
1.4.2 脂肪细胞鉴定：称量1.4g油红O充分溶解于400ml异丙醇，室温静置过夜，过滤后为贮存液，避光保存。工作液按3倍体积贮存液加入2倍体积蒸馏水临时配制。
油红O染色：吸去培养液，PBS漂洗2次，10%甲醛固定30min，滴入2ml油红O工作液浸染15min。弃油红O工作液，PBS漂洗1次，光镜下观察。1.5 脂肪细胞分组：脂肪细胞诱导分化后，培养液a培养于37OC、5%CO2。随机分为四组：正常对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组，接种于12孔板，每组10孔。培养液中瘦素终浓度正常对照组0ng/ml，低浓度组10ng/ml，中浓度组100ng/ml，高浓度组1 000ng/ml。培养4h后取各组培养液按试剂盒说明检测游离脂肪酸和甘油浓度。收集脂肪细胞行油红O染色，拍照后图像分析。
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1.6培养液中游离脂肪酸浓度检测：按试剂盒步骤检测各组培养液中游离脂肪酸浓度。游离脂肪酸经过有机抽提和铜皂化，进行显色反应，用分光光度计测定546nm OD值，对照标准曲线计算游离脂肪酸浓度。
1.7 测定培养液中甘油浓度：采用GPO Trinder酶学反应，操作按试剂盒说明进行，最后用分光光度计在505nm波长测定各组OD值，绘制标准曲线计算甘油浓度。
1.8 脂肪细胞中脂肪颗粒积分光密度测定：收集各组脂肪细胞行油红O染色，然后沿各孔垂直、水平径在光镜下对染色后的细胞进行拍照，每孔9张。应用Image-pro plus图像分析软件测定脂肪细胞中脂肪颗粒的积分光密度。
1.9 统计学分析：结果以均数±标准差(x±s)表示，应用 SPSS12.0统计软件行单因素方差分析，组间参数两两比较行t检验。
2结果
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2.1 人前脂肪细胞的培养观察：细胞接种后可见大量漂浮的圆形细胞，24h后大部分细胞贴壁。初期细胞体积小，呈纺锤形或梭形，核浆比例大，仍有少数细胞未帖壁；换液后悬浮细胞渐被弃去，剩下贴壁生长的前脂肪细胞。7天左右细胞生长至融合，核浆比例减小，部分可见核分裂相(图1)。
2.2 前脂肪细胞向脂肪细胞诱导分化和鉴定：加入无血清的培养液b后，前脂肪细胞停止增殖，形态由纺锤形或梭形逐渐膨胀，变成椭圆形和圆形，体积增大。48h后细胞内可以观察到圆形颗粒，颗粒每日增多，一周后达到高峰。细胞膜出现皱折，轮廓变淡。此时行油红O染色，可见大小不等的橘红色脂肪颗粒(图2)。
2.3各组游离脂肪酸及甘油浓度、脂肪颗粒积分光密度的检测，见表1。
瘦素作用4h后，各组培养液中游离脂肪酸、甘油浓度及脂肪细胞脂肪颗粒积分光密度检测结果如表1所示。与正常对照组相比，低浓度组、中浓度组、高浓度组游离脂肪酸、甘油浓度均明显增加，差异有统计学意义(P, 百拇医药(巫国辉 赵 锋 袁 铿 李小林)