HLA-DR、HLA-DQ分子在瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞中的变化(2)

http://www.100md.com 2008年3月1日 孙东杰　陈东明　聂芳菲　李　生　赵　霞　鲍卫汉

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     1材料和方法

    1.1 材料来源：实验所用血液标本均来自北京大学第三医院成形外科瘢痕门诊。采用瘢痕疙瘩、扁平瘢痕及正常人外周血各10例用于HLA-DR、HLA-DQ蛋白检测；60例瘢痕疙瘩及110例正常人的外周血用于HLA-DR、HLA-DQ的基因检测。

    1.2 实验方法

    1.2.1 免疫细胞化学方法：外周血单个核细胞涂片的制备：取新鲜外周血，肝素抗凝，用RPMI-1640培养液稀释后，采用密度梯度离心法提取单个核细胞，离心涂片机涂片，直径0.8cm，丙酮固定，-20℃贮存备用。

    免疫细胞化学染色：选用链霉卵白素-过氧化物酶法显示HLA-DR,HLA-DQ蛋白。I抗，鼠抗人HLA-DR、HLA-DQ单克隆抗体及HistostainTM -SP试剂盒由北京中杉金桥生物技术公司购置，DAB显色。

    1.2.2 序列特异性引物多聚酶链式反应(PCR-SSP)方法：基因组DNA的提取[4]：取静脉血5ml，EDTA抗凝，用盐析法提取DNA，测定吸光度值，调整DNA浓度至50～100ng/μl。

    序列特异性引物多聚酶链式反应(PCR-SSP)[5]：Biotest DRB SSP kit(德国)、DQB SSP kit(德国)PCR反应板(德国)内含有32个反应孔，第一孔为阴性对照孔，不含特异性引物，其他31孔含有特异性引物，可检测31个基因位点，31对特异性引物已由公司预先放入反应孔中。基因片段均为120～270bp。PCR反应体系：50μlPCR反应缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2)，含4种200μmol的dNTP，一对引物各为1μmol/L ......

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