Msx1编码区突变与非综合性唇腭裂相关性分析(2)
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1.2 DNA提取：按PUREGENE DNA 纯化试剂盒的说明书 (美国GENTRA公司)抽提外周血白细胞基因组DNA。
1.3 PCR扩增：参照NCBI 基因库公布的Msx1基因序列设计扩增引物, 引物均由上海英骏生物公司合成,编码区1扩增选用大连宝生物公司的LA Tag高保真酶,编码区2扩增采用南京天为公司pfu高保真taq酶。扩增引物由Primer Primer 5.0软件设计。编码区1上游引物(5'-3') 为tggccagtgctgcggcagaa，下游引物(5'-3') 为gttccagacctcctcgcctt，扩增片段长度为701bp；编码区2上游引物(5'-3') 为tgtggacatcgagccttcaa，下游引物(5'-3') 为cactctccgaagtctgatcc，扩增片段长度为877bp。编码区1 GC含量高达73.5%，加入GC Buffer可以降低解链的难度，提高PCR效率，其反应体系为LA Taq 0.3μl，2×GC Buffer25μl，DNTP 8μl，Primer F1μl，Primer R 1μl，DNA模版1μl，加去离子水至50μl；反应条件为94℃1 min，94℃30s、60℃30s、72℃2 min计30个循环，72℃10 min。编码区2反应体系为2×master mix 25μl,Primer F2μl, Primer R 2μl, DNA模版1μl,加去离子水至50μl；反应条件为94℃3 min，94℃30s、55℃30s、72℃1min计30个循环，72℃5min。
1.4 纯化测序：编码区1GC含量高达73.5%，纯化测序由上海英骏公司完成。编码区2GC含量57%，由上海博亚公司完成。对发现阳性结果的核心家庭进行重复测序，以检测测序结果的可靠性，若两次结果不一致，再进行双向测序，保证测序结果的可信度。编码区1正向测序引物为tggccagtgctgcggcagaa ......
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