微粒软骨脱细胞基质复合纤维蛋白凝胶构建软骨组织工程支架材料的研究(2)
1.2.2 软骨细胞的获取和体外扩增:3月龄实验猪,全麻状态下无菌手术切取猪耳软骨块约20mm×20mm×1mm,PBS液冲洗后用眼科剪将其剪碎成约0.5mm×0.5mm×0.5mm大小的微粒,放入约5倍体积0.3%Ⅱ型胶原酶溶液,37℃水浴振荡消化12~16h,离心中止消化,150目不锈钢滤网过滤,滤液1000r/min离心10min,沉淀细胞PBS洗涤后用含20%胎牛血清的DMEM/F-12联合培养基(含维生素C 50μg/ml,双抗100U/ml)制备成细胞悬液,调节细胞浓度约为2×105/ml,接种入75cm2培养瓶中,37℃、5%CO2孵箱中培养,3~4天换液一次,约10天后第一次传代,比例1∶4,传代后生长迅速,约3~4天后第二次传代,比例同样1∶4,再次3~4天后细胞长满瓶底,收集后细胞总数达1.0×108个,用于回植。
1.2.3 C+CMACTM+Fg,C+Fg,CMACTM+Fg复合物的制备:将制备的CMACTM 100mg(干重)放入培养皿中,用含20%胎牛血清的DMEM-F-12培养液5ml于37℃、5%CO2孵箱中浸泡24h,1000r/min离心5min,弃上清,无菌滤纸吸干沉淀物(沉淀1),备用。如前方法获取体外培养1.0×108个软骨细胞,1000r/min离心10min,沉淀细胞备用(沉淀2)。取出凝血酶和纤维蛋白原,快速37℃复温 ......
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