机械应力刺激对培养的人成纤维细胞分泌生长因子的影响(1)
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[摘要]目的：研究单次持续40%幅度的牵拉作用于人皮肤成纤维细胞后bFGF、TGFβ1的表达，初步探讨机械应力作用下细胞增殖的机理。方法：体外培养人正常皮肤成纤维细胞，将细胞转移至牵拉细胞培养模型中的弹性膜上，待细胞贴壁生长至75%～80%融合时，实施40%单次持续牵拉，用WESTERN-BLOT对非牵拉组与牵拉组24h、36h、48h、72h的细胞bFGF、TGFβ1进行检测。结果：牵拉各组及对照组均呈阳性表达，但牵拉48h后两者的表达较未牵拉时明显增加。结论：单次40%持续的牵拉方式可以促进bFGF、TGFβ1表达，可能是导致细胞的增殖。
[关键词]成纤维细胞；机械牵拉；碱性成纤维细胞生长因子；转化生长因子β1
[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2008)05-03
The effect of mechanical stress on the expression of growth factor in human skin fibroblast
, 百拇医药
SHU Mao-guo,YI Cheng-gang,HAN Yan,YANG Li,ZHANG Lin-xi,XIA Wen-sen,LIU Dan,GUO Shu-zhong
(Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi, China)
Abstract:ObjectiveTo study the expression of bFGF,TGFβ1 of human skin fibroblasts treated by mechanical stress.MethodsA new cell culture model was designed, which can load mechanical strain. Primary cultured skin fibroblasts were obtained from full thickness skin residual in skin-graft surgery. The fibroblasts were planted on elastic membranes of the model. After the 75%～80% confluence of the cell was reached, mechanical stretch was applied. The extend degree was 40% in the experiment and after stretching for 24h,36h,48h,72h, and cells were counted to quantify the protein and the expression of the bFGF, the TGFβ1 was detected with western-blot.ResultsThe expression of bFGF and TGFβ1 was positive in all groups,but the expression of growth factors was much more enhanced after stretching for 48h.ConclusionMechanical stretch with 40% extend degree and one time but continues load can increase the expression of bFGF and TGFβ1.The peak time is 48h after stretching.
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Key words: mechanical stress; skin fibroblasts; bFGF；TGFβ1
机械应力刺激培养中的细胞分泌生长因子的相关文献报道较多，但多限于其他类型的细胞，且均以测定mRNA的研究为主，作用方式亦多为周期负压方式。单次足够幅度的刺激是否亦能促进生长因子的分泌，分泌时间上有什么特点，既往的文献则鲜见报道。本实验直接检测40%牵拉延长度的应力作用下bFGF、TGFβ1在牵拉后不同时间点的表达情况，以了解单次较大幅度的应力刺激对培养的皮肤成纤维细胞分泌bFGF、TGFβ1的影响。
1材料和方法
1.1仪器与试剂：净化工作台，倒置相差显微镜，CO2孵箱，细胞牵拉培养模型(自制)，DMEM培养基(Gibco)，胰蛋白酶(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青公司)，Tween-20(Sigma)，垂直平板电泳仪(美国Bio-Rad公司)，硝酸纤维素膜(NC膜)(Clontech)，鼠抗人bFGF一抗(武汉博士德)，鼠抗人TGFβ1一抗(武汉博士德)，羊抗鼠二抗(Sigma)，ECL发光系统(Amersham公司)
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1.2.1 机械牵拉细胞培养模型的制备(见图1、2)：牵拉细胞培养模型采用直接机械牵拉作用的原理，将细胞直接种植在硅胶弹性膜上，待细胞帖壁生长后，牵拉弹性膜，而此时贴壁的细胞亦随着弹性膜的单向拉长而拉长，同时改变细胞与细胞之间的距离。自制的牵拉细胞培养模型采用有机玻璃以及经特殊加工的硅胶膜为主要材料[1]，C060照射(11kGy)备用，牵拉延长度设置为40%。
1.2.2 细胞培养及牵拉的实施：实验所用皮肤成纤维细胞来源于健康人体皮肤，常规行原代培养，传代，实验用3～5代的细胞。0.25%胰酶消化玻璃培养瓶中的正常皮肤成纤维细胞，含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，反复吹打制成细胞悬液，以0.5×104～1×104个/㎝2传至细胞培养盒中，24h后第一次换液，以后每隔48h换液，待细胞长至75%～80%满时，更换培养液，旋动培养盒外的螺母，拉动盒内的螺杆，牵引固定板上的弹性膜，根据培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长40% ，继续置二氧化碳孵箱中培养。实验分为对照组(未牵拉组)与牵拉24h、36h、48h、72h共5组。
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1.2.3 bFGF及TGFβ1的检测：收集牵拉与非牵拉组细胞各1×106个，蛋白裂解液裂解提取蛋白，行蛋白电泳，用WESTERN-BLOT法测定蛋白含量，将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜(NC)上，加一抗(稀释倍数为1：200)，将膜装入塑料袋中，加入PBST稀释好的二抗液，用滤纸将膜上液体吸干，在ECL反应物中反应，压X-线片，定影、显影。
1.2.4 蛋白条带采用Smartview 2001的采集、分析。
2结果
2.1牵拉不同时间点bFGF的表达：结果显示对照组与实验组牵拉各时间点(24h、36h、48h、72h)在分子量为18KD处均可见有阳性表达，通过对各蛋白条带行图像分析可看出，随着牵拉时间点的后移，蛋白条带的密度呈逐渐升高的趋势，到牵拉48h时密度值达到最高，之后下降(图3)。
2.2 生物电泳图像分析系统采集密度值(表1)：, 百拇医药(舒茂国 易成刚，韩 岩 杨 力 张琳西 夏文森 刘 丹 郭树)