中药治疗黄褐斑实验研究进展(1)
黄褐斑(Melasma)是一种获得性色素沉着性皮肤病，多发于中青年女性，病程顽固，严重影响患者美观，给其精神和生活带来诸多烦恼和痛苦。而中药治疗黄褐斑具有突出整体调节、副作用小、疗效稳定等优点，故成为治疗黄褐斑的有效理想途径。从20世纪90年代开始，我国中医药工作者在中药治疗黄褐斑的实验研究方面做了大量卓有成效的工作，新技术、新手段不断被引入，新思路、新方法大量涌现。本文就近年来中药治疗黄褐斑的实验研究方法综述如下。
1临床实验研究
临床为中药实践的大舞台，中药治疗黄褐斑的实验研究也是从临床开始的。罗小光等[1]考察了灯盏花素与中药内服外敷联合运用对女性黄褐斑患者血清性激素水平的影响，患者血清E2明显下降，FSH、LH虽无统计学意义，但低于对照组，T在疗前疗后均无显著性变化，表明此种联合治疗方法可能是通过调节内分泌、平衡性激素水平而达到改善黄褐斑的目的。刘冬梅等[2]观察肾阳不足型黄褐斑患者的发病机制并验证养颜青娥丸的有效性及作用机理，发现养颜青娥丸能提高肾阳不足型黄褐斑患者血清的超氧化物歧化酶(SOD) 活性并降低丙二醛(MDA)的活性和血清 E2的水平，从而降低酪氨酸酶活性，减少黑素的形成，使黑素的形成受到抑制而对黄褐斑产生疗效。张琳等[3]采用双盲法进行沙棘斑婷含片改善黄褐斑的试验，有效率为69.81%，受试者主观感觉良好，血液生化指标均正常。张红梅等[4]进行了沙棘清妍胶囊祛黄褐斑的实验研究，总有效率60%，试验前后受试者血常规、尿常规及血生化指标均在正常范围，对试验者身体健康无明显影响。
2动物实验研究
黄褐斑药理动物模型的研究也正在起步，研究方法有紫外光照射法、雌激素攻击法等，但仍属探索阶段，至今尚无公认可行的造模方法。潘扬等[5]用中波紫外线照射雌性白色豚鼠1个月，豚鼠皮肤黑素沉着增加，皮肤和肝脏的酪氨酸、MDA含量明显升高，SOD含量降低，表明紫外线攻击雌性白色豚鼠可作为黄褐斑的实验动物模型。汪南玥等[6]采用黄体酮+紫外线+束缚复合法建立肝郁型黄褐斑小鼠模型，给小鼠注射黄体酮，同时进行慢性束缚和紫外线局部照射，较其他方法更能导致皮肤MDA升高和 SOD降低以及皮肤黑素细胞的增加，并且具有肝郁证的行动学表现，模型获得成功。王志国等[7]用黄体酮攻击雌性小鼠复制黄褐斑实验动物模型，探讨蝴蝶霜治疗黄揭斑的作用机理，证明蝴蝶霜能提高局部皮肤组织中SOD活性和羟脯氨酸含量，降低乳过氧化物酶(LPO)和脂褐质含量，消除多余自由基，从而抑制黄褐斑的产生。金道山等[8]采用老年雌性大鼠为实验动物模型，观察大豆异黄酮软胶囊治疗黄褐斑与其抗氧化能力间的关系，发现大豆异黄酮软胶囊能提高大鼠血及肝组织中SOD、GSH-PX活性，降低MDA含量，提示大豆异黄酮软胶囊治疗黄褐斑与其抗氧化能力间有密切关系。李洪武等[9]选定体外对酪氨酸酶活性有显著抑制作用的中药，应用棕黄色豚鼠UVB照射诱导皮肤色素沉着实验动物模型，观察外用中药后黑素细胞数量和形态的改变，结果白术、茯苓、山茱萸等中药组多巴阳性黑素细胞数及含黑素颗粒细胞数较对照组明显减少，对UVB诱导的色素沉着具有抑制作用；又选择对酪氨酸酶活性和皮肤黑素生成均具有显著抑制作用的中药制成乙醇提取液，UVB照射后外用于豚鼠背部皮肤，采用半定量RT-PCR检测药物干预前后豚鼠皮肤中酪氨酸酶mRNA表达水平，结果显示茯苓、白术能在基因转录水平下调酪氨酸酶RNA表达，抑制酶蛋白的生物合成 [10]。
3酪氨酸酶抑制实验
通过研究中药对黑素生物合成过程中的关键酶—酪氨酸酶的激活或抑制作用，为中药治疗黄褐斑提供选择。酪氨酸酶(TYR)是皮肤黑素生物合成的主要限速酶，控制其活力即可控制黑素生成量。李艳莉等[11]测定6种中药对酪氨酸酶活性的抑制率，白芷、白附子、当归、云苓、蒺藜、银杏叶对酪氨酸酶活性的抑制率分别为35.14%、55.86%、30.63%、21.62%、54.46%、39.29%，白附子对酪氨酸酶活性抑制作用最强。夏蕾等[12]用电脑筛选出高频次治疗色素增加性皮肤病的中药，研究其对酪氨酸酶的活性影响，发现白术、白僵蚕、藁本、白芨、白附子等15味中药有使酪氨酸酶活性增加的作用；治疗色素性皮肤病最常用的复方中药中，六味地黄丸、补中益气汤、复方金匾肾气丸及茯苓、山药、山茱萸能使酪氨酸酶活性降低，柴胡舒肝汤、白蚀丸复方及熟地黄、牡丹皮能使得酪氨酸酶活性增加；单体18-甘草酸双氨盐、芦荟素、肉桂酸、苦参碱对酪氨酸酶活性和黑素形成有抑制作用。雷铁池等[13]对中医治疗色素增加性皮肤病方剂69首进行计算机拆方排序，选出高频次出现中药82味，观察这些中药乙醇提取物对蘑菇酪氨酸酶和无细胞系统多巴色素自动氧化生成黑素量的影响；结果显示11味中药乙醇提取物在3个不同浓度对酪氨酸酶活性和黑素生成量呈剂量依赖性抑制，其中白术、白僵蚕、藁本、白芨、白附子、沙苑子、六月雪、柿叶对酪氨酸酶活性抑制率与单体化合物熊果苷无统计学差异；进一步研究这些中药的皮肤脱色机制及评估其临床应用，发现白术、茯苓等体外可显著抑制蘑菇酪氨酸酶活性。还有学者认为部分中药对酪氨酸酶(TYR)有双向调节作用，许振毅等[14]发现高浓度芦荟大黄素和低浓度大黄次酸对TYR的抑制率分别为54%和55%，低浓度的芦荟大黄素和高浓度的大黄次酸对TYR活性可提高至70%和81%。
4对黑素细胞影响的研究
黑素细胞是一种腺细胞，黑素是其分泌产物，为吲哚和醌与蛋白质结合的高分子聚合物。
4.1 对小鼠黑素瘤细胞影响的研究：B-16黑素瘤细胞株的基本结构，特别是黑素合成功能与人正常的皮肤黑素细胞基本一致，在人体原代皮肤黑素细胞培养非常困难的情况下，国外化妆品生产企业的科研单位，在筛选美白祛斑剂的过程中，广泛采用该细胞株作为美白化学物功效测定的受试细胞。雷铁池等[15]通过B-16小鼠黑素瘤细胞对几种美白化学物进行测试发现，熊果苷可明显抑制黑素合成。李玲等[16]利用B-16小鼠黑素瘤细胞研究显示，熊果苷、曲酸衍生物、BL-99和氢醌酯均可抑制黑素细胞的生长和黑素合成，具有一定的美白效果，其机制可能不仅仅与酪氨酸酶活性有关。周婧等[17]研究表明，小鼠B-16 黑素瘤细胞经槲皮素作用后，细胞内TYR mRNA和蛋白表达上调，活性增强，进而黑素合成增多；槲皮素浓度<60μmol/L时，无细胞毒性，且有轻度的促进细胞增殖的作用。陈氏等[18]研究表明，养颜青娥丸能明显抑制小鼠B-16黑素瘤细胞的增殖，并降低酪氨酸酶的活性、减少黑素的合成，证实了其对肾虚型黄褐斑的治疗作用。
4.2 对melan-a细胞影响的研究：Melan-a鼠黑素细胞株系来源于新生C57BL鼠皮肤的永生化二倍体黑素细胞，基因型为agouti/agouti(纯合子，显性)，该细胞保留了正常黑素细胞的特征；Melan-a鼠黑素细胞株接种到同种系小鼠或裸鼠身上，不能诱发黑素瘤的发生，该细胞株广泛应用于黑素转运、药物对黑素合成的影响等方面研究[19-20]。Me1an-a鼠黑素细胞株细胞比B16、S91等黑素瘤细胞株更接近于普通黑素细胞，成为人们研究体外黑素细胞生物学特性的合适媒介。鲁严等[21]研究芦荟素对Melan-a鼠黑素细胞株的黑素生成及其相关基因表达的影响，表明芦荟素能够显著抑制Melan-a鼠黑素细胞株的TYR活性、黑素量和TRP-1/TRP-2 mRNA的表达水平，直接测定黑素细胞TYR浓度和黑素量比检测TRP-1/TRP-2 mRNA更能确切地反映芦荟素对黑素细胞的影响。又观察了苦参碱和肉桂酸对melan-a小鼠黑素细胞黑素生成的影响，表明苦参碱和肉桂酸均有抑制melan-a小鼠黑素细胞酪氨酸酶活性的作用及使黑素合成量减少的作用，且苦参碱作用强于肉桂酸，而肉桂酸有促进黑素细胞树突形成的作用[22]。, 百拇医药(张 宁 陈巧云 任燕冬 陈景华 杨智荣)
1临床实验研究
临床为中药实践的大舞台，中药治疗黄褐斑的实验研究也是从临床开始的。罗小光等[1]考察了灯盏花素与中药内服外敷联合运用对女性黄褐斑患者血清性激素水平的影响，患者血清E2明显下降，FSH、LH虽无统计学意义，但低于对照组，T在疗前疗后均无显著性变化，表明此种联合治疗方法可能是通过调节内分泌、平衡性激素水平而达到改善黄褐斑的目的。刘冬梅等[2]观察肾阳不足型黄褐斑患者的发病机制并验证养颜青娥丸的有效性及作用机理，发现养颜青娥丸能提高肾阳不足型黄褐斑患者血清的超氧化物歧化酶(SOD) 活性并降低丙二醛(MDA)的活性和血清 E2的水平，从而降低酪氨酸酶活性，减少黑素的形成，使黑素的形成受到抑制而对黄褐斑产生疗效。张琳等[3]采用双盲法进行沙棘斑婷含片改善黄褐斑的试验，有效率为69.81%，受试者主观感觉良好，血液生化指标均正常。张红梅等[4]进行了沙棘清妍胶囊祛黄褐斑的实验研究，总有效率60%，试验前后受试者血常规、尿常规及血生化指标均在正常范围，对试验者身体健康无明显影响。
2动物实验研究
黄褐斑药理动物模型的研究也正在起步，研究方法有紫外光照射法、雌激素攻击法等，但仍属探索阶段，至今尚无公认可行的造模方法。潘扬等[5]用中波紫外线照射雌性白色豚鼠1个月，豚鼠皮肤黑素沉着增加，皮肤和肝脏的酪氨酸、MDA含量明显升高，SOD含量降低，表明紫外线攻击雌性白色豚鼠可作为黄褐斑的实验动物模型。汪南玥等[6]采用黄体酮+紫外线+束缚复合法建立肝郁型黄褐斑小鼠模型，给小鼠注射黄体酮，同时进行慢性束缚和紫外线局部照射，较其他方法更能导致皮肤MDA升高和 SOD降低以及皮肤黑素细胞的增加，并且具有肝郁证的行动学表现，模型获得成功。王志国等[7]用黄体酮攻击雌性小鼠复制黄褐斑实验动物模型，探讨蝴蝶霜治疗黄揭斑的作用机理，证明蝴蝶霜能提高局部皮肤组织中SOD活性和羟脯氨酸含量，降低乳过氧化物酶(LPO)和脂褐质含量，消除多余自由基，从而抑制黄褐斑的产生。金道山等[8]采用老年雌性大鼠为实验动物模型，观察大豆异黄酮软胶囊治疗黄褐斑与其抗氧化能力间的关系，发现大豆异黄酮软胶囊能提高大鼠血及肝组织中SOD、GSH-PX活性，降低MDA含量，提示大豆异黄酮软胶囊治疗黄褐斑与其抗氧化能力间有密切关系。李洪武等[9]选定体外对酪氨酸酶活性有显著抑制作用的中药，应用棕黄色豚鼠UVB照射诱导皮肤色素沉着实验动物模型，观察外用中药后黑素细胞数量和形态的改变，结果白术、茯苓、山茱萸等中药组多巴阳性黑素细胞数及含黑素颗粒细胞数较对照组明显减少，对UVB诱导的色素沉着具有抑制作用；又选择对酪氨酸酶活性和皮肤黑素生成均具有显著抑制作用的中药制成乙醇提取液，UVB照射后外用于豚鼠背部皮肤，采用半定量RT-PCR检测药物干预前后豚鼠皮肤中酪氨酸酶mRNA表达水平，结果显示茯苓、白术能在基因转录水平下调酪氨酸酶RNA表达，抑制酶蛋白的生物合成 [10]。
3酪氨酸酶抑制实验
通过研究中药对黑素生物合成过程中的关键酶—酪氨酸酶的激活或抑制作用，为中药治疗黄褐斑提供选择。酪氨酸酶(TYR)是皮肤黑素生物合成的主要限速酶，控制其活力即可控制黑素生成量。李艳莉等[11]测定6种中药对酪氨酸酶活性的抑制率，白芷、白附子、当归、云苓、蒺藜、银杏叶对酪氨酸酶活性的抑制率分别为35.14%、55.86%、30.63%、21.62%、54.46%、39.29%，白附子对酪氨酸酶活性抑制作用最强。夏蕾等[12]用电脑筛选出高频次治疗色素增加性皮肤病的中药，研究其对酪氨酸酶的活性影响，发现白术、白僵蚕、藁本、白芨、白附子等15味中药有使酪氨酸酶活性增加的作用；治疗色素性皮肤病最常用的复方中药中，六味地黄丸、补中益气汤、复方金匾肾气丸及茯苓、山药、山茱萸能使酪氨酸酶活性降低，柴胡舒肝汤、白蚀丸复方及熟地黄、牡丹皮能使得酪氨酸酶活性增加；单体18-甘草酸双氨盐、芦荟素、肉桂酸、苦参碱对酪氨酸酶活性和黑素形成有抑制作用。雷铁池等[13]对中医治疗色素增加性皮肤病方剂69首进行计算机拆方排序，选出高频次出现中药82味，观察这些中药乙醇提取物对蘑菇酪氨酸酶和无细胞系统多巴色素自动氧化生成黑素量的影响；结果显示11味中药乙醇提取物在3个不同浓度对酪氨酸酶活性和黑素生成量呈剂量依赖性抑制，其中白术、白僵蚕、藁本、白芨、白附子、沙苑子、六月雪、柿叶对酪氨酸酶活性抑制率与单体化合物熊果苷无统计学差异；进一步研究这些中药的皮肤脱色机制及评估其临床应用，发现白术、茯苓等体外可显著抑制蘑菇酪氨酸酶活性。还有学者认为部分中药对酪氨酸酶(TYR)有双向调节作用，许振毅等[14]发现高浓度芦荟大黄素和低浓度大黄次酸对TYR的抑制率分别为54%和55%，低浓度的芦荟大黄素和高浓度的大黄次酸对TYR活性可提高至70%和81%。
4对黑素细胞影响的研究
黑素细胞是一种腺细胞，黑素是其分泌产物，为吲哚和醌与蛋白质结合的高分子聚合物。
4.1 对小鼠黑素瘤细胞影响的研究：B-16黑素瘤细胞株的基本结构，特别是黑素合成功能与人正常的皮肤黑素细胞基本一致，在人体原代皮肤黑素细胞培养非常困难的情况下，国外化妆品生产企业的科研单位，在筛选美白祛斑剂的过程中，广泛采用该细胞株作为美白化学物功效测定的受试细胞。雷铁池等[15]通过B-16小鼠黑素瘤细胞对几种美白化学物进行测试发现，熊果苷可明显抑制黑素合成。李玲等[16]利用B-16小鼠黑素瘤细胞研究显示，熊果苷、曲酸衍生物、BL-99和氢醌酯均可抑制黑素细胞的生长和黑素合成，具有一定的美白效果，其机制可能不仅仅与酪氨酸酶活性有关。周婧等[17]研究表明，小鼠B-16 黑素瘤细胞经槲皮素作用后，细胞内TYR mRNA和蛋白表达上调，活性增强，进而黑素合成增多；槲皮素浓度<60μmol/L时，无细胞毒性，且有轻度的促进细胞增殖的作用。陈氏等[18]研究表明，养颜青娥丸能明显抑制小鼠B-16黑素瘤细胞的增殖，并降低酪氨酸酶的活性、减少黑素的合成，证实了其对肾虚型黄褐斑的治疗作用。
4.2 对melan-a细胞影响的研究：Melan-a鼠黑素细胞株系来源于新生C57BL鼠皮肤的永生化二倍体黑素细胞，基因型为agouti/agouti(纯合子，显性)，该细胞保留了正常黑素细胞的特征；Melan-a鼠黑素细胞株接种到同种系小鼠或裸鼠身上，不能诱发黑素瘤的发生，该细胞株广泛应用于黑素转运、药物对黑素合成的影响等方面研究[19-20]。Me1an-a鼠黑素细胞株细胞比B16、S91等黑素瘤细胞株更接近于普通黑素细胞，成为人们研究体外黑素细胞生物学特性的合适媒介。鲁严等[21]研究芦荟素对Melan-a鼠黑素细胞株的黑素生成及其相关基因表达的影响，表明芦荟素能够显著抑制Melan-a鼠黑素细胞株的TYR活性、黑素量和TRP-1/TRP-2 mRNA的表达水平，直接测定黑素细胞TYR浓度和黑素量比检测TRP-1/TRP-2 mRNA更能确切地反映芦荟素对黑素细胞的影响。又观察了苦参碱和肉桂酸对melan-a小鼠黑素细胞黑素生成的影响，表明苦参碱和肉桂酸均有抑制melan-a小鼠黑素细胞酪氨酸酶活性的作用及使黑素合成量减少的作用，且苦参碱作用强于肉桂酸，而肉桂酸有促进黑素细胞树突形成的作用[22]。, 百拇医药(张 宁 陈巧云 任燕冬 陈景华 杨智荣)
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