大鼠骨髓间充质干细胞与成纤维细胞差异蛋白质组学研究(2)
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1.2.4 蛋白分离及图像分析：消化分离出细胞，在4℃以3 000r/min的速度离心10min，弃去上清液，加入预冷的PBS洗涤3次。在裂解液中重悬细胞，在冰浴冷却下超声破碎细胞。分别加入脱氧核糖核酸酶200ml和核糖核酸酶50mL，于4℃放置15min，以12 000r/min的速度离心30min。收集上清液，用Bradford法测定蛋白含量，在-80℃中保存蛋白样品。采用2DE方法分离细胞蛋白提取物。
1.2.5 质谱分析及数据库检索：对蛋白点胶内酶切，提取多肽混合物。用MALDI-TOF-MS法(Voyager-DE)检测蛋白多肽。采用moverz软件对多肽质谱进行校正，通过peakErazor软件去除各种污染，如胰酶自降解峰以及角蛋白污染峰等。采用不同的检索引擎(Aldente, Profound, MS-Fit)对两种不同的数据库(NCBInr和Swiss-Prot)蛋白进行数据检索[1]。
2结果
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2.1 MSCs和FBs形态观察：MSCs和FBs形态相似，均呈梭形贴壁生长(图1)。
2.2流式细胞仪对大鼠MSCs表面抗原鉴定结果：大鼠MSCs表面抗原 CD29呈阳性，而CD34和CD45呈阴性，表明实验所用细胞为MSCs，并且在增殖过程中能够保持其特征。可排除造血干细胞的污染(图2)。
2.3 特征蛋白的鉴定：采用pH=3～10的IPG胶条分离MSCs和FBs蛋白提取液，结果见图3。PDQuest软件分析MSCs和FBs蛋白点变化情况。结果表明：MSCs与FBs表达的蛋白质谱很相似，但仍存在差异。MSCs具有的而FBs不具有的蛋白点有3个，MSCs多而FBs少的蛋白点有5个，MSCs少而FBs多的蛋白点5个，MSCs没有而FBs有的蛋白点有2个。这些蛋白点将作为质谱分析的对象进行胶内酶解及质谱分析，成功地鉴定出4个有意义的蛋白点，即SM22-a、GD、Annexin A5、SOD-2。MSCs 的SM22-α和Annexin A5的表达分别比FBs低26倍和8倍，而MSCs的GD和SOD-2表达分别比FBs高16倍和21倍。4个蛋白点的肽质量指纹图谱如图4所示。
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3讨论
FBs曾作为组织工程种子细胞，但其功能存在缺陷。MSCs是一种多能干细胞，具有自我增殖和多向分化的潜能，目前认为其作为组织工程种子细胞有很好的应用前景。在一定条件下，MSCs可诱导分化为FBs，但MSCs与FBs的蛋白组学功能差别的分子结构基础，尚未见深入研究报道。本试验对大鼠MSCs和FBs研究发现这两种细胞形态相似，均呈梭形，并均贴壁生长。MSCs表面抗原CD29为阳性，CD34和CD45为阴性。本研究进一步对两种细胞进行蛋白分离和蛋白组学比较研究，发现MSCs与FBs表达的蛋白质谱很相似，但仍存在差异。MSCs具有的而FBs不具有的蛋白点有3个，MSCs多而FBs少的蛋白点有5个，MSCs少而FBs多的蛋白点5个，MSCs没有而FBs有的蛋白点有2个。将这些蛋白点作为质谱分析的对象进行胶内酶解及质谱分析，成功地鉴定出4个有意义的蛋白点，即SM22-a、GD、Annexin A5、SOD-2。细胞蛋白表达上的差异，导致了两种细胞具有不同的功能，通过蛋白质组的鉴定，我们发现以上四种主要差异的蛋白质均与MSCs保持高度增殖和分化能力有关。
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SM22-a可在多种间质细胞中表达[2]，与细胞的衰老有关，分化程度越高的细胞表达SM22-a越多[3]。蛋白质组的研究结果显示MSCs与FBs相比SM22-a表达少，说明MSCs分化程度较低，是更年轻的细胞，具备高分化潜能。GD是核苷酸代谢的关键酶，催化水解的脱氨基作用，使鸟嘌呤转化为黄嘌呤[4-5]。GD在细胞成熟过程中发挥重要作用[6]。蛋白质组的结果显示MSCs表达的GD比FBs表达多，证实了MSCs是未成熟细胞，仍含有较多的促进细胞成熟的酶功能活跃，催化细胞的成熟。
Annexin A5是与细胞衰老过程密切相关的蛋白，在细胞凋亡的过程中，Annexin A5相互结合[7]。蛋白质组的结果显示MSCs表达的Annexin A5比FBs少，提示MSCs是比FBs更年轻的细胞。SOD-2是一种抗氧化剂，可以提高多种酶mRNA的水平，SOD-2水平的提高可以防止细胞的损伤[8]。蛋白质组的结果显示MSCs表达的SOD-2水平高于FBs，提示MSCs处于较幼稚的阶段，机体对其产生了良好的保护机制[9]。
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综上所述，MSCs和FBs蛋白表达谱相似，故具有相似的生物学功能，均可作为组织工程种子细胞。但两者蛋白表达仍存在不同，导致了两者功能的差别。本研究第一次从蛋白水平阐述了MSCs和FBs不同功能与蛋白表达差异的关系，找到了4种有意义的差异蛋白质，可以更深入的理解MSCs具备高分化潜能而FBs不具备的原因，为选择更适合的组织工程种子细胞提供了更多的理论依据，并由此推断MSCs作为组织工程种子细胞具有更广泛应用的前景。
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[收稿日期]2008-02-21[修回日期]2008-05-13
编辑/张惠娟, 百拇医药(孙 阳 赵 亮 魏旭峰 易 蔚 郭树忠)