TGF-β1对UVA照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型，Ⅲ型胶原合成和表达的影响(2)
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1材料和方法
1.1 主要仪器：UVA 光源(北京光学仪器厂)，紫外线辐照计(北京师范大学)，Clinibio 128C 型酶标仪(ASYS HitechGmbH,奥地利)，PCR仪( Perkin Elmer公司,美国)，紫外分光光度计 U-niversal Hood Ⅱ型紫外凝胶成像系统(Bio-Rad公司,意大利) 。
1.2 主要试剂：DMEM，小牛血清，青霉素，链霉素，胰酶， Trizol试剂(MRC,美国)；AMV-逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶( Promega,美国)；及内参照β-acting引物；MMP-1,MMP-3，TGF-β1、Ⅰ型、Ⅲ型胶原引物。Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1 ELISA试剂盒( TP I,美国) 。
1.3 皮肤成纤维细胞原代培养及传代：所用的皮肤取自20～23岁成年男性包皮环切术后的皮肤组织,共6 例，术前检查均无结缔组织疾病及其他全身系统疾病。利用组织块培养法,加入含20%小牛血清的DMEM 培养液,1周后成纤维细胞爬出。待融合80%后常规消化传代,取第5代对数增殖期细胞作为实验用细胞。
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1.4 不同浓度TGF-β1干预 UVA照射体外培养的成纤维细胞：将细胞接种在6 孔板上,浓度为1×105/ml，以UVA15J/ cm2照射成纤维细胞。细胞分为5组，即正常对照组(对照组不照射也不加入TGF-β1，只加入等量PBS)、UVA单纯照射组(TGF-β1 0ng/ml)、小剂量组(UVA+TGF-β1 0.1ng/ml)、中剂量组(UVA+TGF-β1 1ng/ml)、大剂量组(UVA+TGF-β1 10.0 ng/ml)。UVA紫外灯选用北京光学仪器厂UVA360nm灯管6根并排照射，先将紫外线灯管消毒后置入超净台中，HH-S恒温水浴箱严格消毒后加入三蒸水置入超净台中，用超净台紫外灯消毒30min。照射前将长波紫外灯置于恒温水浴箱上，测量灯管与96孔板照射平面之间距离为12cm，用北京师范大学光电仪器厂紫外辐照计测量此平面UVA照射功率，测量前长波紫外灯预热30min，待照射功率稳定后测得功率为18.8mJ/s,照射时以PBS置换培养基，掀开盖子，在恒温水浴箱中将细胞暴露于UVA辐照装置下，照射距离为12cm。照射前2h加入含不同浓度TGF-β1、PBS液各3ml，培养板置入37℃恒温水浴箱中，照射后置换含10%小牛血清的DMEM置入培养箱中继续培养,24h 后收样。
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1.5MTT法检测TGF-β1干预后成纤维细胞增殖活性：用含10%胎小牛血清加培养液配成单个细胞悬液，以每孔10 000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μl，培养1天后，每孔加5mg/ml MTT溶液20μl。继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解，选择492nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
1.6ELISA检测TGF-β1对UVA照射体外培养成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量的影响：收集细胞上清液标本：①建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔设3复孔，每个孔中各加入标本稀释液100μl，第一孔加标准品100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔，如此反复作倍数稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100μl 弃去，使之体积均为100μl，第八孔为空白对照；②加样：待测品孔每孔各加入待测样品100μl，每个样品设3个复孔；③将反应板充分混匀后置37℃120min；④洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干；⑤每孔中加入第一抗体工作液50μl；⑥将反应板置37℃60min；⑦ 洗板：同前；⑧每孔加酶标抗体工作液100μl；⑨将反应板置37℃60min；⑩洗板：同前；⑾每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗处反应5～10min；⑿每孔加入50μl终止液混匀；⒀在492nm处测吸光值。
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1.7 半定量RT-PCR检测TGF-β1对UVA照射体外培养成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达水平的影响： RNA提取，半定量RT-PCR分析：用磷酸缓冲液(PBS) 洗三次,使用Trizol 提取RNA。首先进行反转录反应：取10μg RNA 加入到20μl 反转录反应混合液中,经94℃ 30min,99℃ 5min 和5℃ 5min 处理。在含有反转录产物的PCR 反应液中, 分别加入：
Ⅰ型胶原引物 (285bp)
上游引物 5′-GGT TTG GAG AGG CAT GAC C-3′
下游引物 5′-TTT GGG AAA TTG AGT TTG G-3′
Ⅲ型胶原引物(447bp)
上游引物 5′-ATG GTG GCT TTC AGT TCA CC-3′
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下游引物 5′-TGG GGT TTC AGA GAG TTT GG -3′
Β-acting做内参照引物(510bp)
上游引物 5′-GCA CTC TTC CAG CCT TTC CTG-3′
下游引物 5′-GGA GTA CTT GCG CTC AGG AGG AGC-3′
PCR 反应体积为25μl。扩增条件：预变性94℃6min,接着94℃50s,55℃50s,72℃1.5min，30个循环后72℃7min延伸。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳,紫外凝胶成像系统扫描成像扩增产物。
1.8 统计学处理 ：数据以(x±s)表示，用SPSS 13.0统计学软件对组间数据行单因素方差分析，P<0.05有显著性差异。
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2结果
2.1 TGF-β1对成纤维细胞增殖活性的影响：选择UVA 15 J/cm2照射前给予不同剂量TGF-β1干预后，结果显示：正常对照组成纤维细胞OD值明显高于UVA 照射组，有非常显著性差异(P<0.01)；TGF-β1处理后，随着TGF-β1剂量增加，OD值升高，大、中剂量组OD值与UVA 照射组比较，有非常显著性差异(P<0.01)(表1)。
2.2 TGF-β1对成纤维细胞细胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量的影响：正常对照组Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量明显高于UVA照射组，有非常显著性差异(P<0.01)。TGF-β1处理后，随着TGF-β1剂量增加，Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量升高，呈剂量依赖关系。大剂量组、中剂量组与UVA照射组比较，有显著性差异(P<0.01，P<0.05),大剂量组对UVA照射保护作用更明显，与UVA照射组比较，有非常显著性差异(P<0.01),小剂量组处理后Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量无显著性差异(P>0.05)(表2)。, 百拇医药(王继华 刘 垠 何永静 杜永贵 赵亚南)