腺病毒与慢病毒载体对人脂肪间充质干细胞转导效率及基因表达的差异(2)
1.2 重组腺病毒、慢病毒载体体外感染hADSCs:本实验应用的病毒载体均携带巨细胞病毒CMV启动子调控的增强型绿色荧光蛋白( EGFP)报告基因:5型、外壳纤维为35型嵌合型重组腺病毒(Ad5F35-EGFP)滴度为9×109 pfu/ml;第三代慢病毒(LV-EGFP),滴度为2×108 TU/ml,由北京本原正阳基因技术有限公司提供。采用第3代hADSCs,按每孔1×105接种到24孔板中,1天后细胞贴壁,将Ad5F35-EGFP及LV-EGFP分别以感染复数(multiple of infection,MOI)=0、25、50、100、200、400、800,其中MOI=0为对照组,加入到hADSCs细胞培养液中,置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养12h后,培养液更换为含10%FCS的L-DMEM。
1.3 重组腺病毒、慢病毒载体对体外培养hADSCs的转导效率及增殖的影响:病毒载体对hADSCs的转导效率用报告基因EGFP的表达来反映。分别于感染后1、3、7、14、21天,感染细胞在倒置荧光显微镜(LSN 510,Zeiss)下观察EGFP的表达,以表达EGFP细胞为阳性细胞。同时各组感染细胞分别加入0.25%胰蛋白酶消化,250μl PBS重悬后于200目滤网过滤送检,应用流式细胞仪对各组EGFP阳性细胞率进行定量分析 ......
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