人脂肪干细胞向血管平滑肌细胞诱导分化的实验研究(1)
[摘要]目的:体外诱导培养人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs),观察是否可以分化形成血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs),为构建组织工程化血管寻找新的种子细胞来源。方法:免疫磁珠法分选收集原代脂肪干细胞,加入PDGF-BB、TGF-β1诱导14天后进行检测。结果:实验组细胞生长呈现血管平滑肌细胞所特有的峰谷样生长,血管平滑肌细胞特有的表面抗原标记物表达阳性。结论:脂肪干细胞定向诱导培养后,具有血管平滑肌细胞的特性,有可能成为构建组织工程化血管新的种子细胞来源。
[关键词]脂肪干细胞;血管平滑肌细胞;血小板衍生生长因子;转化生长因子β1
[中图分类号]Q813.1 R622.4 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)02-0215-03
Experiments of adscs induced into vascular smooth muscle cells
, 百拇医药
JIANG Wei1,CAO Qiang1,WANG Ji-hua2,FENG Xing-hua1
(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China; 2. Department of Plastic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650101,Yunnan,China)
Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of ADSCs differentiating into VSMCs in vitro and to find the new source of seeding cells in constructing the tissue-engineered vessels.MethodsTo separate the cells from the original adipose stem cells by MACS and culture 14 days with PDGF-BB and TGF-β1.ResultsThe cells show "peak and valley" growth pattern specified as mature VSMCs and express the VSMC's markers.ConclusionADSCs were induced in vitro in specific environment,the cells show the significant characteristics of VSMCs and have the potentiality being seeding cells of construct the tissue-engineered vessels.
, 百拇医药
Key words: adipose-derived stem cells; vascular smooth muscle cells; platelet derived growth factor BB; transforming growth factor beta
脂肪干细胞由中胚层分化发育而来,具有类似于骨髓间充质干细胞的干细胞特性[1],可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞和成骨细胞分化[2],而且脂肪干细胞取材更方便、更容易获取。研究发现:体外培养ADSCs可表达肌源性标志物MyoD1 和肌球蛋白重链[3],体内实验也证明其表达α- 肌动蛋白[4]。本实验观察研究了脂肪干细胞在特定的诱导环境下,向血管平滑肌细胞分化的情况。
1材料和方法
1.1 主要试剂与仪器:FBS、M-199 培养基(Gibco公司,美国);TGF-β1(transforming growth factor, TGF-β1)、PDGF-BB(platelet derives growth factor-BB, PDGF-BB)(Sigma公司,美国);单克隆鼠抗人α平滑肌肌动蛋白(α-SMA,Dako Cytomation公司,美国);单克隆鼠抗人平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC,Chemicon公司,加拿大);单克隆鼠抗人Calponin、单克隆羊抗人SM22α(Abcam公司,美国);倒置相差显微镜(Olympus公司,日本);LSN-510 激光共聚焦显微镜(Zeiss公司,德国)。
, 百拇医药
1.2 ADSCs 分离培养与传代:脂肪组织由脂肪抽吸术获得,37℃摇床中0.075%Ⅰ型胶原酶消化PBS清洗的脂肪,60min,加入同体积含10% FBS的M-199 培养液终止消化。300×g离心10min,去上清,100目滤网过滤,加入10%M199培养液吹打均匀接种,恒温培养24h后PBS去除未贴壁的细胞。
1.3 免疫磁珠(MACS)细胞分选:胰酶消化法收集生长至融合的原代细胞,离心去除上清,加入5%BSA/PBS吹打均匀,200目滤网过滤后离心去除上清,加入CD34b和CD34fc,比例为100μl/108cells,4°C避光30min,加入5%BSA洗除未结合抗体,离心去除上清,加入5%BSA进行免疫磁珠分选,得到CD34+的细胞。
1.4 实验分组:分选出的CD34+细胞生长至融合后,酶消化法收集细胞,以2×104个/cm2接种于培养皿,实验组用加入含2.5ngTGFβ1、50 ng/ml PDGF-BB的5% M199培养液培养,对照组以5%M199培养液培养。
, 百拇医药
1.5 检测指标
1.5.1 常规培养并隔日换培养液每日观察细胞生长情况和形态特征变化。
1.5.2 免疫荧光检测:培养14天后,收集两组细胞,用乙醇及冰醋酸以99:1 比例固定15min,PBS漂洗,10%羊血清封闭30min,加入以0.1% BSA稀释的1:100 抗体:α-SMA、SM-MHC和Calponin,4℃过夜,PBS漂洗,滴加FITC标记相应二抗,37℃孵育30min,PBS漂洗,碘化丙啶衬核后,荧光显微镜下观察。胞浆内绿色荧光为阳性表达,细胞核为红色荧光。
2结果
2.1形态学:原代培养的脂肪干细胞贴壁后呈纺锤形或梭形,类成纤维细胞生长(图1A);MACS分选获得的脂肪干细胞生长呈纺锤形(图1B),诱导48h后,形态较对照组有所增大并有一定方向性(图1C),7天后呈现血管平滑肌细胞所特有的“峰-谷”样生长(图1D);对照组细胞形态呈梭形或纺锤形,类成纤维样生长,约5～6天可生长至融合。
2.2 免疫荧光检测(图2):分别取诱导生长14天的实验组和对照组细胞,制作爬片后进行免疫荧光检测,结果显示实验组表达血管平滑肌细胞特有的表面抗原标记物α-SMA、Calponin、SM22α和SM-MHC,对照组无阳性表达,IgG为不加一抗,只加FITC二抗的自发光图片。绿色为阳性表达,红色为衬染的细胞核。, http://www.100md.com(蒋 威 曹 强 王继华 封兴华)
[关键词]脂肪干细胞;血管平滑肌细胞;血小板衍生生长因子;转化生长因子β1
[中图分类号]Q813.1 R622.4 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)02-0215-03
Experiments of adscs induced into vascular smooth muscle cells
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JIANG Wei1,CAO Qiang1,WANG Ji-hua2,FENG Xing-hua1
(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China; 2. Department of Plastic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650101,Yunnan,China)
Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of ADSCs differentiating into VSMCs in vitro and to find the new source of seeding cells in constructing the tissue-engineered vessels.MethodsTo separate the cells from the original adipose stem cells by MACS and culture 14 days with PDGF-BB and TGF-β1.ResultsThe cells show "peak and valley" growth pattern specified as mature VSMCs and express the VSMC's markers.ConclusionADSCs were induced in vitro in specific environment,the cells show the significant characteristics of VSMCs and have the potentiality being seeding cells of construct the tissue-engineered vessels.
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Key words: adipose-derived stem cells; vascular smooth muscle cells; platelet derived growth factor BB; transforming growth factor beta
脂肪干细胞由中胚层分化发育而来,具有类似于骨髓间充质干细胞的干细胞特性[1],可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞和成骨细胞分化[2],而且脂肪干细胞取材更方便、更容易获取。研究发现:体外培养ADSCs可表达肌源性标志物MyoD1 和肌球蛋白重链[3],体内实验也证明其表达α- 肌动蛋白[4]。本实验观察研究了脂肪干细胞在特定的诱导环境下,向血管平滑肌细胞分化的情况。
1材料和方法
1.1 主要试剂与仪器:FBS、M-199 培养基(Gibco公司,美国);TGF-β1(transforming growth factor, TGF-β1)、PDGF-BB(platelet derives growth factor-BB, PDGF-BB)(Sigma公司,美国);单克隆鼠抗人α平滑肌肌动蛋白(α-SMA,Dako Cytomation公司,美国);单克隆鼠抗人平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC,Chemicon公司,加拿大);单克隆鼠抗人Calponin、单克隆羊抗人SM22α(Abcam公司,美国);倒置相差显微镜(Olympus公司,日本);LSN-510 激光共聚焦显微镜(Zeiss公司,德国)。
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1.2 ADSCs 分离培养与传代:脂肪组织由脂肪抽吸术获得,37℃摇床中0.075%Ⅰ型胶原酶消化PBS清洗的脂肪,60min,加入同体积含10% FBS的M-199 培养液终止消化。300×g离心10min,去上清,100目滤网过滤,加入10%M199培养液吹打均匀接种,恒温培养24h后PBS去除未贴壁的细胞。
1.3 免疫磁珠(MACS)细胞分选:胰酶消化法收集生长至融合的原代细胞,离心去除上清,加入5%BSA/PBS吹打均匀,200目滤网过滤后离心去除上清,加入CD34b和CD34fc,比例为100μl/108cells,4°C避光30min,加入5%BSA洗除未结合抗体,离心去除上清,加入5%BSA进行免疫磁珠分选,得到CD34+的细胞。
1.4 实验分组:分选出的CD34+细胞生长至融合后,酶消化法收集细胞,以2×104个/cm2接种于培养皿,实验组用加入含2.5ngTGFβ1、50 ng/ml PDGF-BB的5% M199培养液培养,对照组以5%M199培养液培养。
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1.5 检测指标
1.5.1 常规培养并隔日换培养液每日观察细胞生长情况和形态特征变化。
1.5.2 免疫荧光检测:培养14天后,收集两组细胞,用乙醇及冰醋酸以99:1 比例固定15min,PBS漂洗,10%羊血清封闭30min,加入以0.1% BSA稀释的1:100 抗体:α-SMA、SM-MHC和Calponin,4℃过夜,PBS漂洗,滴加FITC标记相应二抗,37℃孵育30min,PBS漂洗,碘化丙啶衬核后,荧光显微镜下观察。胞浆内绿色荧光为阳性表达,细胞核为红色荧光。
2结果
2.1形态学:原代培养的脂肪干细胞贴壁后呈纺锤形或梭形,类成纤维细胞生长(图1A);MACS分选获得的脂肪干细胞生长呈纺锤形(图1B),诱导48h后,形态较对照组有所增大并有一定方向性(图1C),7天后呈现血管平滑肌细胞所特有的“峰-谷”样生长(图1D);对照组细胞形态呈梭形或纺锤形,类成纤维样生长,约5～6天可生长至融合。
2.2 免疫荧光检测(图2):分别取诱导生长14天的实验组和对照组细胞,制作爬片后进行免疫荧光检测,结果显示实验组表达血管平滑肌细胞特有的表面抗原标记物α-SMA、Calponin、SM22α和SM-MHC,对照组无阳性表达,IgG为不加一抗,只加FITC二抗的自发光图片。绿色为阳性表达,红色为衬染的细胞核。, http://www.100md.com(蒋 威 曹 强 王继华 封兴华)