内质网分子伴侣GRP94\GRP78和XBP1在病理性瘢痕中的表达初探(2)
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1.1.2 主要试剂及仪器:DMEM培养基(美国Gibco公司)、胎牛血清(美国HyClone公司)、氢化可的松注射液(北京双鹤药业股份有限公司)、焦碳酸二乙酯(DEPC,美国Sigma公司)、组织及细胞RNA提取试剂盒、RT-PCR 试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)。凝胶成像及分析系统(英国Syngene公司)。
1.1.3 基因引物:目的基因及内参基因GAPDH 的引物序列均引自文献[8-10], 由上海生工生物工程公司合成。引物序列分别是:GRP94上游5′- CAG TTT TGG ATC TTG CTG TGG -3′,GRP94下游5′- CAG CTG TAG ATT CCT TTG C -3′, 扩增片段长度为270bp;GRP78上游5′- CTG GGT ACA TTT GAT CTG ACT GG -3′,GRP78下游5′- GCA TCA TGG TGG CTT TCC AGC CAT TC -3′,扩增片段长度为398bp;XBP1上游5′- CCT TGT GTA GTT GAG AAC CAG G -3′,XBP1下游5′- GGG GCT TGG TAT ATA TGT GG -3′,扩增片段长度为442bp(mRNA被剪切前)或416bp(mRNA被剪切后);GAPDH上游5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT CA-3′,GAPDH下游5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′,扩增片段长度为250bp。
1.2 实验方法
1.2.1细胞培养及处理:采用组织块培养法进行成纤维细胞的原代培养。待细胞几乎长满成致密单层后,用0.25%胰蛋白酶消化,传代。实验所用成纤维细胞为第2～5代细胞。
细胞约80%融合时给予氢化可的松,同时设未给药组;96h后,提取细胞总RNA。
1.2.2 RT-PCR法检测目的基因的表达量:取适量液氮冻存的组织,提取总RNA;每例细胞标本取2×106个成纤维细胞,加1mlTrizol 试剂提取细胞总RNA ......
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