人小涎腺成纤维样单克隆细胞的成骨分化(2)
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1.3 原代培养:取唇裂患者术中暴露于上唇粘膜切口内需要切除废弃的含小涎腺的组织,去除多余的结缔组织,分离得到完整的小涎腺,滴少量培养基以保持组织块湿润,用眼科剪将其剪成大约1mm3的碎块,均匀的铺于培养瓶底部,间距平均5mm,加好培养基后竖立放于培养箱中,4h后放倒使组织块完全浸在培养液中,4天后首次观察换液,以后每3天换一次液。原代培养10～14天。
培养基为完全培养基:DMEM-F12 1:1,10%胎牛血清,1%青/链霉素。
1.4 克隆培养方法(96孔板稀释铺板法):组织块贴壁法长出的原代细胞用0.25%胰酶37°C消化1min,获得成纤维样细胞,计数,稀释至10个细胞/ml,以100μl/孔接种于96孔板,过夜贴壁后,镜下观察,挑选出只有1个细胞的孔,待细胞80%融合后依次传代至24孔培养板,6孔培养板和25cm2培养瓶。
克隆培养基: DMEM/F12 1:1,10%胎牛血清,牛胰岛素5μg/ml,地塞米松 10-7mol/L,铁传递蛋白5μg/ml,Hu EGF 20ng/ml,HGF 50ng/ml。
1.5 鉴定克隆细胞:每例患者随机选取三个克隆,分别用CD13、CD29、CD44、CD106抗体进行免疫荧光染色,检测克隆细胞的免疫表型。
分别提取上述9组单克隆细胞的RNA,测定样品在260nm的吸收值确定RNA的纯度和浓度。RT-PCR检测CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因在人小涎腺成纤维样克隆细胞与骨髓间充质干细胞中的表达,比较差异。RT-PCR使用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0。
实验步骤均按试剂盒说明书操作。检测基因的引物、大小和退火温度见表1。
1.6 成骨诱导分化及鉴定:成骨诱导:将克隆细胞接种于预置玻片的35mm培养皿,待长到70%～80%融合时换成骨诱导培养基,每3天换液一次。成骨诱导培养基:DMEM(LG),10%胎牛血清,1%青/链霉素,0.1μM地塞米松,维生素C50μM,β-甘油磷酸钠10mM ......
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