PPARγ激动剂对成人正常皮肤成纤维细胞转分化的作用(2)
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1.3.3 Western blot检测α-SMA蛋白表达:将各组细胞裂解液以BCA法进行蛋白定量,取40μg总蛋白以SDS-PAGE分离,半干法电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭,以鼠抗人α-SMA单克隆抗体(稀释比例1:500)作为一抗,4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(稀释比例1:4000)作为二抗,室温孵育2h,增强化学发光法显影。显影底片经Quantity One图像分析软件进行定量分析,以内参β-actin的吸光度(A)值为对照,其余电泳条带的A值与之相比所得比值表示结果。
1.3.4 实时荧光RT-PCR检测α-SMA mRNA水平:细胞总RNA提取及mRNA反转录参照试剂说明书进行。α-SMA上游引物:5′CAATGTCCCTGCCATGTACGTC 3',下游引物:5′GGCAGGGCATAG-CCTTCATAGA 3′。反应体系20 μl,含cDNA 5 ng,10 μl SYBR Green混合液,5 μmol/L 的引物1μl。采用Bio-Rad 的IQ5 系统进行SYBR Green 荧光定量PCR 分析,结果采用IQ5 软件行CT 值相对定量分析,以GAPDH 为内参,每个样品基因重复3管。
1.4 统计学方法:采用SPSS11.0统计软件包进行统计学处理,实验数据以 x±s表示,采用完全随机设计资料的方差分析行LSD-t检验。
2结果
2.1PPARγ激动剂对TGF-β1诱导的肌成纤维细胞转分化的影响:免疫荧光染色结果显示,α-SMA阳性表达为红色荧光,DAPI复染后细胞核呈蓝色荧光(图1)。以图像分析技术获得对照组、TGF-β1诱导组、10μM曲格列酮、15d-PGJ2预处理组的光密度平均值分别为0.101±0.011、0.878±0.029、0.303±0.024、0.195±0.034,统计学分析表明,TGF-β1诱导组的α-SMA阳性表达高于对照组(P<0.01),而经曲格列酮、15d-PGJ2分别预处理后其α-SMA表达明显低于TGF-β1诱导组,差异有统计学意义(P<0.01) ......
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