CXCR4靶向shRNA质粒载体的制备和体外鉴定(3)
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自然界中存在3种干涉mRNA的机制:反义RNA、核酶和RNAi[14]。siRNA 的优点在于:在抑制基因表达的效果上,双链RNA对靶基因的抑制效果至少比单链反义RNA的抑制效果强2个数量级。事实上,反义RNA的基因抑制效果可能取决于它形成dsRNA的能力。相对于反义RNA和核酶技术,RNAi沉默效果基本不受RNA二级结构的影响。在体外得到siRNA后再导入细胞内有两方面无法克服的缺点:siRNA进入细胞后容易被降解;进入细胞siRNA的数量不受控制。针对这种情况,出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。
shRNA通过载体导入细胞后,利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。shRNA最大的优势是利用载体上的抗生素标记可以建立相对稳定的长期基因沉默细胞株,或者通过病毒插入基因组中从而得到稳定的基因沉默表达株。此外,载体上的抗生素筛选还可以排除未转染的细胞,以避免混杂的未转染细胞中的目标基因mRNA干扰后继的定量检测结果。shRNA质粒载体除了可以做长期基因沉默,还可重复使用[15]。
本实验综合体内表达shRNA设计原则,由专业人员在线设计,以确保设计的siRNA序列的有效性。本实验采用质粒载体介导的shRNA转染效率高,稳定性好,对细胞的和组织的毒副作用小,在细胞中持续长期抑制靶基因的表达,适合基因治疗和长期研究。实验结果表明,以CXCR4为靶向的shRNA质粒载体能够有效下调CXCR4基因的表达,达到CXCR4基因沉默效应,为下一部分实验奠定了基础。
[参考文献]
[1]Sibley CR, Seow Y, Wood MJ. Novel RNA-based strategies for therapeutic gene silencing[J]. Mol Ther,2010,18(3): 466-476.
[2]Di Cesare S,Marshall JC,Fernandes BF,et al. In vitro characterization and inhibition of the CXCR4/CXCL12 chemokine axis in human uveal melanoma cell lines[J]. Cancer Cell Int, 2007,14(7):17.
[3]Lazennec G,Richmond A. Chemokines and chemokine receptors:new insights into cancer-related inflammation[J]. Trends Mol Med,2010,16(3):133-144.
[4]Wu X,Lee VC,Chevalier E,et al. Chemokine receptors as targets for cancer therapy[J]. Curr Pharm Des,2009,15(7): 742-757.
[5]Gelmini S,Mangoni M,Serio M,et al. The critical role of SDF-1/CXCR4 axis in cancer and cancer stem cells metastasis[J]. J Endocrinol Invest, 2008, 31(9): 809-819.
[6] Murakami T,Cardones AR, Hwang ST. Chemokine receptors and melanoma metastasis[J].J Dermatol Sci,2004,36(2): 71-78.
[7]Payne AS,Cornelius LA. The role of chemokines in melanoma tumor growth and metastasis[J] ......
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