杜仲对UVA致HaCaT细胞光老化保护作用的实验研究(2)
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参见附件(1563KB，3页)。
1.6指标观测
1.6.1细胞形态:用倒置显微镜观察各组细胞的形态变化。
1.6.2细胞活性:向每孔(含100μl培养液)加入20μl浓度为5μg/ml的MTT,孵育4h,弃上清,加入150μl DMSO,置恒温培养振荡器内振荡10min,酶标仪测定各孔在492nm处吸光值(OD值)。按公式2计算细胞活性。
细胞活性=OD实验组/OD对照组×100%……公式2
1.6.3 LDH、SOD、MDA测定:按LDH、SOD、MDA测定试剂盒说明进行检测。
1.7统计处理:由SPSS 13.0软件完成数据分析。
2结果
2.1 对细胞形态的影响:倒置显微镜可观察到空白对照组细胞形态一致,边界清楚,排列紧密。模型组细胞数减少,细胞贴壁性降低,细胞间隙增大,细胞变圆或不规则,细胞体积变小,部分细胞裂解成细胞碎片,并有大量漂浮细胞。与模型组相比,125μg/ml的50%乙醇大孔树脂洗脱部位给药组细胞形态未发生明显改变。见图1。
2.2 对细胞活性的影响:结果见表1,与空白对照组相比,模型组细胞活性显著降低,二者具有显著性差异(P<0.01),表明造型成功;而50%乙醇大孔树脂洗脱部位在500μg/ml时,细胞活力显著降低(P<0.01),表明药物浓度太大,产生细胞毒作用,细胞存活率降低。与模型组相比,50%乙醇大孔树脂洗脱部位在125μg/ml时,细胞活性明显升高(P<0.05);水洗脱部位4个剂量组细胞活性均无明显提高;表明50%乙醇大孔树脂洗脱部位能够在一定程度上抵抗UVA对细胞活性的抑制。
2.3 对细胞培养液中LDH活力的影响:结果见表2,与空白对照组相比,模型组细胞培养液中LDH活力显著升高(P<0.01),表明造模型成功;而50%乙醇大孔树脂洗脱部位在500μg/ml时,细胞培养液中LDH活力显著升高(P<0.01),表明药物浓度太大,产生细胞毒作用,引起细胞LDH的泄漏。与模型组相比,50%乙醇大孔树脂洗脱部位在125μg/ml时,细胞培养液中LDH活力显著降低(P<0.01);水洗脱部位在125μgoml-1时,细胞培养液中LDH活力明显降低(P<0.05);表明50%乙醇大孔树脂洗脱部位和水洗脱部位均能够降低UVA辐射引起的HaCaT细胞LDH的泄漏量,而50%乙醇大孔树脂洗脱部位作用更加显著。
2.4 对细胞培养液中SOD、MDA活力的影响:结果见表2,与空白对照组相比,模型组细胞培养液中SOD活力明显降低(P<0.05),MDA活力明显升高(P<0.05),表明造模型成功;而50%乙醇大孔树脂洗脱部位在500μg/ml时,细胞培养液中SOD活力显著降低(P<0.01),MDA活力显著升高(P<0.01),表明药物浓度太大,产生细胞毒作用,使细胞氧化损伤严重。与模型组相比,50%乙醇大孔树脂洗脱部位在125μg/ml时,细胞培养液中SOD活力明显升高(P<0.05),MDA活力明显降低(P<0.05);水洗脱部位对细胞培养液中SOD、MDA活力均无明显影响;表明50%乙醇大孔树脂洗脱部位能够抵抗UVA辐射引起的细胞氧化损伤。
以上结果表明,50%乙醇大孔树脂洗脱部位能提高细胞活性(P<0.05),使细胞培养液中LDH显著降低(P<0.01)、SOD活力明显提高(P<0.05)、MDA活力明显降低(P<0.05);水洗脱部位仅使细胞培养液中LDH活力明显降低(P<0.05);提示杜仲抗皮肤光老化作用的有效成分主要集中在50%乙醇大孔树脂洗脱部位。
3讨论
本实验结果显示,杜仲50%乙醇大孔树脂洗脱部位可通过提高SOD活力,加速氧自由基的清除和减少氧自由基的产生,使UVA所致的HaCaT细胞的脂质过氧化损伤程度得以降低。同时,50%乙醇大孔树脂洗脱部位可以降低UVA作用的HaCaT细胞LDH活力,减轻其所致细胞的不可逆损害。其机制可能是杜仲通过抗氧化作用,维持了细胞膜结构和功能的完整性,LDH的漏出减少;至于杜仲是否有直接地抑制LDH合成或加速LDH代谢的作用尚待进一步的研究。水洗脱部位仅对细胞培养液中LDH活力有一定作用,暂时不对其进行深入研究。
任何化学物达到一定浓度时均可引起器官、组织或细胞损伤。预实验中发现500μg/ml的给药剂量为毒性剂量,故我们选择了该范围内的4个浓度(500、250、125、62.5μg/ml)进行研究。
结合本课题组前期研究结果,发现杜仲50%乙醇大孔树脂洗脱部位对UVA和UVB[7]致HaCaT细胞光老化均有良好的保护作用,可以确定50%乙醇大孔树脂洗脱部位是抗皮肤光老化的有效部位。但50%乙醇大孔树脂洗脱部位仍是一个复合物,其抗皮肤光老化活性成分仍不清楚。在本研究结果的基础上,可以利用HaCaT细胞进行体外生物活性指导下的有效成分的分离分析,使确定50%乙醇大孔树脂洗脱部位中的有效单体结构以及后续结构改造成为可能。50%乙醇大孔树脂洗脱部位抗皮肤光老化的成分、分子机制等有待进一步研究。本研究为杜仲抗衰防皱功效型产品的研制以及我国杜仲资源的二次开发奠定基础,为中药抗皮肤光老化的现代研究提供方法学借鉴。
[参考文献]
[1]顾恒,常宝珠,陈崑.光皮肤病学[M] ......
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