siRNA c-Met腺病毒转染对人外泌汗腺上皮细胞增殖的影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(1496KB，3页)。
1.2.3 SiRNA met腺病毒转染hESGc细胞:第1代的hESGc细胞接种于6孔板,KSFM培养,细胞的密度约60%～80%时,测定hESGc细胞的最适感染复数,每孔分别加入AdR-siRNA c-Met 0μl、2μl、4μl、8μl、16μl、48h后,在荧光显微镜下观察,统计表达RFP的细胞百分比(感染效率),取感染效率80%以上,同时细胞没有明显由病毒本身引起的细胞毒现象的病毒量,最终确定为4μl AdR-siRNA c-Met病毒液/孔。同理对照组Ad-RFP合适的病毒量亦为4μl Ad-RFP病毒液/孔。由于培养hESGc细胞时,6孔板每孔中培养基约1ml,故适合用于转染的病毒浓度为4μl病毒原液/ml培养基。
1.2.4 Westernblot检测: 培养14h后,细胞用PBS洗两遍后,加入新鲜的KSFM培养基,转染后48h,取细胞做westernblot检验,明确AdR-siRNA c-Met的有效性。设置对照组(无影响因素),阳性对照组(Ad-RFP转染)和实验组(AdR-siRNA c-Met转染),在转染后48h收集各组细胞,加入RIPA细胞裂解液,超声破碎细胞,提取各组细胞总蛋白并采用BCA定量,取等量总蛋白(40μg)上样,电泳,电转, 5%脱脂牛奶封闭3h, 加一抗(兔抗c-Met多克隆抗体,小鼠抗β-actin 抗体),室温孵育2h,洗膜,加二抗(抗兔IgG-HRP,抗小鼠IgG-HRP),室温孵育1h,洗膜,化学发光法检测,曝光,显影,定影,记录实验结果,Western blot 法测得所有数据均采用UVP BioImaging Systems 采集,将X 线片扫描后的图像数据输入LabWork 3.0 软件进行图像分析,将内参β-actin 作为标准积分吸光度(standard integral absorbance,SIA),各目的条带相对积分吸光度值(relativeintegral absorbance,RIA)=样本积分吸光度值(integral absorbance,IA)/ SIA。
1.2.5 MTT法检测细胞增殖: 实验分成4组,空白组,对照组,阳性对照组和实验组。空白组不含细胞,仅于96孔板加入200μl KSFM,对照组,阳性对照组和实验组均于96孔板按 2×103个/孔接种hESGc,对照组每孔加入200μl KSFM,阳性对照组每孔加入含4μl /mL Ad-RFP 腺病毒的KSFM 200?l,实验组每孔加入含4μl /ml AdR-siRNA c-Met 的KSFM 200μl 。每一组每一时相点设六复孔。各组在0天,2天,4天时采用MTT法检测细胞增殖情况。从孵箱中取出待测96 孔板,每孔加入MTT 溶液(5g/L)20μl,继续培养4h,弃上清,每孔加入DMSO 100μl,振荡10min,在Bio-Tek 多功能读板机570 nm 波长测定吸光度(A)值,并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(阳性对照组A 值-实验组A 值)/ 阳性对照组A值×100%。
1.2.6 统计学方法:采用SPSS11.0 统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK,P值<0.05 为有统计学意义。
2结果
2.1 SiRNA c-Met重组腺病毒转染hESGc:所构建的pSES-HUS-siRNA c-Met干扰序列由美国芝加哥大学医学中心测序中心测序,包含目的基因在内的序列正确。hESGc细胞转染了AdR-siRNA c-Met后,荧光显微镜下可见红色荧光蛋白表达(见图1)。
2.2 Westernblot检测:hESGc细胞转染AdR-siRNA c-Met后48h,收集细胞进行westernblot检测,结果发现,AdR-siRNA c-Met转染能抑制hESGc细胞中c-Met蛋白的表达(见图2),通过UVP BioImaging Systems 采集图像后分析发现,对细胞中c-Met蛋白的抑制能达到70%以上。
2.3 MTT 法检测细胞活力:在加入腺病毒转染之前,各组间A 值比较差异无统计学意义(P>0.05)。腺病毒转染hESGc后,2天,4天均能抑制细胞的增殖,实验组A值与阳性对照组和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),抑制率分别为16.8%(2天)和34.5%(4天),但对照组与阳性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
3讨论
HGF是一个多效应生长因子,具有多种生物活性,参与机体多种器官组织细胞生长、再生和重塑,研究表明,HGF对多种细胞均有促进增殖和运动的作用,如BMSCs、平滑肌细胞、牙髓细胞、肾小管上皮细胞、角膜上皮细胞以及视网膜上皮细胞等[6-8]。c-Met是HGF特异性受体,其在组织中广泛存在,但是上皮细胞中表达浓度最高[9]。HGF与c-Met结合后,可诱导其发生构像变化,激活受体胞内蛋白激酶结构域中的蛋白酪氨酸激酶(PTK) ,使受体自身的酪氨酸残基磷酸化而激活受体[10]。除自身磷酸化外,c-Met 蛋白的酪氨酸激酶活性可导致多种底物蛋白的酪氨酸磷酸化,经瀑布式磷酸化反应,将信号逐级放大,最终转入细胞核内的转录机构,导致细胞的增殖、分化[11]。
汗腺起着排汗,调节体温,物质交换等重要作用,深入研究汗腺细胞的生物学行为的影响因素,对揭示汗腺及其他管状系统的发育和功能有着重要的意义,我们既往的研究表明[12],hESGc上有HGF特异性受体c-Met表达,含40～80ng/ml的HGF的培养基能明显促进hESGc的增殖,20～40ng/ml HGF可促进hESGc细胞移行(P<0 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(1496KB，3页)。