Cyclin D1和p16在肥大乳房腺体组织中的表达及意义(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(2286KB，4页)。
1.1.4 正常对照组患者应行病理诊断确诊为正常腺体组织,排除其他病变,回避月经期。术前必须征得患者同意。
1.2 标本来源及分组:所有病例均来自2007年9月～2009年3月间,武汉市协和医院收治的要求行乳房缩小整形术的患者。以及同期收治的乳房体积在正常范围(250～350ml)的行其他乳房手术患者。
1.2.1 肥大乳房组:共35例,年龄13～37岁,平均年龄22.3岁,乳房体积平均值为(852.33±144.20)ml。根据年龄段分为三组:13～20岁,21～30岁,31～37岁。
1.2.2 正常发育乳房组:共16例,年龄15～41岁,平均年龄24岁,乳房平均体积为(261.32±16.51)ml。
两对照组的年龄无统计学差异。
1.3 实验方法及判断标准
1.3.1免疫组织化学染色:采用SP法,主要步骤为:二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水, 高压组织抗原修复,正常山羊血清37℃封闭,滴加羊兔一抗(KIT-0305,羊抗鼠/兔,迈新生物)4℃冰箱孵育过夜,次日分别滴加二抗(Rabbit Anti-Cyclin D1(RMA-0541,福州迈新),P16(Mab20070710,远泰生物),DAB显色10～15min,苏木素复染胞核,脱水透明并用中性树胶封片。
1.3.2CD1染色的诊断标准[5]:cyclinD1蛋白表达定位于胞核,胞核呈黄色或棕黄色颗粒着色为阳性细胞,染色结果在高倍镜下,每例样本中随机选择十个视野,每个视野中细胞数不少于500个细胞,利用光密度分析仪来检测阳性细胞的百分率。若细胞的阳性率>10%为阳性表达(+),>50%为强阳性表达(++)。
1.3.3P16染色的诊断标准[6]:p16蛋白在胞质中的反应性可以被忽略,唯有在胞质背景中的细胞核染色才认为是p16蛋白的表达的证据,染色结果在高倍镜下,每例样本中随机选择十个视野,每个视野中细胞数不少于500个细胞,利用光密度分析仪来检测阳性细胞的百分率。若细胞的阳性率>10%为阳性表达(+),<10%为阴性表达。
1.4统计学处理:应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,利用χ2检验方法,当P<0.05时认为差异具有显著性。
2结果
2.1 CyclinD1蛋白免疫组化染色定位于乳腺导管上皮细胞的细胞核内,呈黄色或棕色的颗粒(图3)。高倍镜下,随即选取10个视野,每个视野中细胞数不少于500个,利用IPP光密度分析仪,分析阳性细胞数目,然后计算阳性细胞的百分比,阳性细胞率>10%则说明该样本阳性表达,>50%为强阳性表达,<10%则为阴性表达(图4)。p16蛋白在胞质中的反应性可以被忽略,唯有在胞质背景中的细胞核染色才认为是p16蛋白的表达的证据。染色结果在高倍镜下,每例样本中随机选择十个视野,每个视野中计数不少于500个细胞,来计算阳性细胞的百分率。若细胞的阳性率>10%为阳性表达(+)(图5),<10%为阴性表达(图6)。
2.2 在肥大乳房组, CyclinD1阳性表达(+/++)者18例(51.4%),阴性表达者17例(48.6%),在对照组16例正常乳房腺体组织中,无一例CyclinD1阳性表达,,利用χ2检验分析实验数据,比较两组间CyclinD1蛋白的表达,差异具有统计学意义(αP<0.05,χ2=11.572)(表1)。在肥大乳房组,p16阴性表达者27例(77.2%),p16阳性表达者8例(32.8%),正常体积乳房组,p16阴性表达者11例(68.8%),阳性表达者5例,利用χ2检验分析实验数据,比较两组间p16蛋白的表达,差异具有统计学意义(αP<0.05,χ2=87.51)(表2)。即说明CyclinD1的高表达与p16的低表达可能参与了乳房肥大的发生和发展。
2.3 在18例CyclinD1阳性表达中,p16阴性表达者17例,阳性表达者1例,在17例CyclinD1阴性表达中,p16阴性表达者10例,阳性表达者8例(表3),利用Pearson相关性分析,发现在肥大乳房组中CyclinD1和p16的表达呈负相关(r=-0.32,P<0.05)。
2.4 为了分析年龄因素是否与两种蛋白的异常表达有关系,将样本分为三个不同的年龄组:13～20岁,21～30岁,31～37岁,利用R×C表χ2检验分别分析两指标在各年龄组间表达的差异,结果显示不同年龄组CyclinD1及p16蛋白的表达无明显统计学差异(表4、5),即说明,年龄不是影响两种蛋白异常表达的相关因素。
3讨论
CyclinD(CD)是一组控制真核细胞周期发展的重要细胞周期调节蛋白,分子量36KD,有三种不同的亚型:CyclinD1,CyclinD2和CyclinD3,其中Cyclin D1(CD1)是其中一个重要亚型。CyclinD1与G1/S期调控相关,其主要的作用机理为:细胞在雌激素、生长因子等生长信号的刺激下,G1期Cyclin D1表达增加,然后与相应的细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(CDK4、CDK6)结合,形成CD/CDK复合体。CDKs本身没有活性,它的激活依赖于与调节亚基Cyclins的结合,激活后,可使下游的效应蛋白(如视网膜母细胞瘤蛋白pRb蛋白)被磷酸化,磷酸化的Rb蛋白调控转录因子2(E2F)的表达,进而促进下游许多基因的转录,如编码CDK1和CyclinE、A的基因,最终通过一系列的反应促使细胞越过限制点加速增殖。Cyclin D1的过表达会加快细胞周期的进行,加速细胞的分裂,从而导致组织或器官的增生和肥大,甚至会使细胞向恶性转化。因此,CyclinD1基因被认为可与多种癌基因协同促进细胞转化,是一种弱致癌基因。在多种肿瘤中有CyclinD1基因扩增或表达增强,如:乳腺癌[7]、食道癌[8]、喉癌[9]、胃腺癌[10]等,其临床意义与肿瘤的类型有关。在相关乳腺疾病的研究中显示CyclinD1可用于良、恶性乳腺疾病的鉴别,并且CyclinD1与雌激素受体ER有明显的相关性[11-12] ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2286KB，4页)。