PCNA和CD44v6在皮肤鳞状细胞癌和基底细胞癌中表达的研究(2)
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1.2方法
1.2.1固定和石蜡包埋:所有标本经10%中性甲醛常规固定,石蜡包埋。制成4μm厚连续切片,分别做HE染色和免疫组化染色。
1.2.2免疫组化染色方法:①石蜡切片脱蜡和水化后,用PBS(PH7.4)冲洗三次,每次3min;②取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液置于微波盒中,用大火煮开,再将组织片浸没在修复液中,加盖,中火煮15min,取出微波盒,冷却至室温后,取出组织片;③每张切片加50μl过氧化酶阻断溶液 (试剂A),以阴断内源性过氧化物酶的活性,室温下孵育10min;④PBS(PH7.4)冲洗(3×3ˊ);⑤沥干PBS液,每张切片加50μl的非免疫性动物血清(试剂B),室温孵育10min;⑥甩去血清,分别加PCNA(浓度1:100)和CD44v6 (浓度1:300)工作液50μl,4℃冰箱中过夜;⑦第二天将过夜切片用PBS冲洗3×5ˊ;⑧沥干PBS液,每张切片加50μl生物素标记的第二抗体(试剂C),室温孵育20min;⑨PBS冲洗3次,每次3min;⑩沥干 PBS液,每张切片加50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D),室温下孵育20min;PBS冲洗3次,每次3min;⑾沥干PBS液,每张切片加100μl的新鲜配置的酶底物显色液(DAB)进行显色5min;⑿自来水冲洗,苏木素复染,用中性树胶进行封片;⒀用PBS代替一抗作空白对照。
1.3 免疫组化结果判定:CD44v6蛋白阳性表达为细胞膜上有棕黄色颗粒样物质沉着。PCNA蛋白阳性表达为细胞核内有棕黄色颗粒样物质沉着。结果判定采用半定量积分法,免疫组化染色记分标准如表1,以染色强度与阳性细胞的百分比的和做为每例标本积分。0～1分为阴性(-),2分为弱阳性(+),3～5分为阳性(++),大于5分为强阳性(+++)[4]。
1.4统计学处理:应用SPSS10.0软件分析系统,采用χ2检验和精确概率法及计数资料的相关性分析,以P﹤0.05时认为有统计学意义。
2结果
2.1PCNA、CD44v6在正常皮肤、皮肤SCC和皮肤BCC中的表达:PCNA阳性定位于癌细胞胞核中,少量见于胞核。在正常皮肤中,PCNA表达于表皮基底细胞,偶见毛囊根部、皮脂腺周围少数细胞呈阳性表达。高分化SCC中主要位于癌巢周围,向中央逐渐减弱或呈阴性,低分化SCC中表现为弥散分布。从正常皮肤到BCC,直到SCC,PCNA表达逐渐增强,各组间阳性表达率比较有统计学意义(P﹤0.05)。CD44v6的阳性表达定位于癌细胞胞膜上。在正常皮肤标本中,CD44V6表达于基底细胞层及棘细胞层。高分化SCC中阳性染色主要位于癌巢周边部,低分化病例中散在分布。从正常皮肤到SCC,直到BCC,CD44v6表达逐渐下降,各组间阳性表达率比较有统计学意义(P﹤0.05),见表2～3。
2.2 PCNA和CD44v6与皮肤SCC的分化程度关系:PCNA在皮肤SCC高、中、低分化组中高表达率分别为33.3%,69.2%,93.3%,MMP9的高表达与皮肤SCC分化程度呈负相关(χ2=10.881,P﹤0.01)。
CD44v6在皮肤SCC高、中、低分化组中高表达率分别为60.0%,23.1%,7.1%,CD44v6的高表达与皮肤SCC分化程度呈正相关(χ2=13.940,P﹤0.01),见表4。
2.3CD44v6与PCNA在皮肤SCC和BCC中表达的相关性
在42例皮肤SCC中,CD44v6蛋白表达阳性组28例中,PCNA阳性表达为24例,阳性表达率为85.71%, CD44v6蛋白表达阴性组14例中,PCNA阳性表达有14例,阳性表达率为100%。Spearman相关性分析显示两者表达无相关性(相关系数r=-0.1342,P=0.122﹥0.05)。
在25例皮肤BCC中,CD44v6蛋白表达阳性组5例中,PCNA阳性表达有3例,阳性表达率为60%, CD44v6蛋白表达阴性组20例中,PCNA阳性表达有9例,阳性表达率为45%。Spearman相关性分析显示两者表达无相关性(相关系数r=0.1200,P=0.198﹥0.05)。
3讨论
增殖细胞核抗原(PCNA)是真核生物复制复合体的核心成分, 具有特殊的环状三级结构。作为真核细胞DNA聚合酶δ的推动因子,与不同复制相关蛋白结合, 协调DNA复制过
程。同时PCNA还作为功能转换因子,通过不同调控方式与多种细胞因子作用, 参与了DNA损伤修复、细胞周期调控及凋亡等许多重要的细胞事件。另外,作为细胞增殖的指标,PCNA与肿瘤等细胞增殖性疾病的发生和发展存在相关性。PCNA的合成和表达是反映细胞增殖的主要生物学指标,本研究表明,SCC组织中PCNA表达量显著高于BCC组织和正常皮肤中PCNA表达量(P﹤0.01),随着SCC分化程度的降低,PCNA表达量明显增高(P﹤0.01),肿瘤的增殖活性被认为是恶性肿瘤的预后特征[5],提示PCNA高表达与皮肤SCC及BCC发生、发展密切相关。
CD44v6是淋巴细胞的导向受体,在淋巴细胞的活化、细胞与细胞间粘附、细胞与基质间相互作用及细胞的运动中发挥多种功能。近年来,广泛的CD44v6研究表明,在消化道癌、肺癌、宫颈癌中CD44v6表达增强,且鳞癌表达高于腺癌,而在皮肤肿瘤、口腔肿瘤[8]中表达下调(与本文相符)。表明CD44v6表达与肿瘤类型及组织来源有关。本文研究显示CD44v6在皮肤鳞癌和基癌中表达明显低于正常皮肤中表达,在皮肤鳞癌中CD44v6高表达与细胞分化程度正相关,提示CD44v6可能在维持角质形成细胞正常形态及增殖分化过程中起作用,并通过与其他淋巴细胞功能相关抗原相互作用发挥局部抗肿瘤免疫作用,癌变过程中细胞获得了表达CD44v6蛋白的阻断信号导致低表达。这也可能与异常增生时细胞粘附力下降有关 ......
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