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编号:11975244
生物型人工皮肤及复合bFGF对兔创面愈合的影响(2)
http://www.100md.com 2010年10月1日 黄建艳,钟杏霞,赵能育,徐斌,徐国风
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    参见附件(2079KB,4页)。

     如表面涂布1%透明质酸,再加入不同质量的bFGF,包装后以Co60照射消毒即制得生物活性人工皮肤。

    1.3形态学观察:取制备的生物型人工皮肤,常规石蜡包埋后,4μm厚切片,进行HE染色,光镜下观察。

    1.4 水蒸汽透过量试验:按GB/T 12704-91规定的方法进行。采用透湿杯法,试验箱温度控制精度为±0.5℃,相对湿度控制精度为±2%,循环气流速度为0.3~0.5m/s。

    1.5 液体吸收量:按YY/T 0472.1-2004中附录C规定的方法时行。试验条件:温度21℃±2℃,湿度60%±15%。

    1.6 力学性能测定:将样品置于RGM-3010型微控电子式拉力试验机做拉伸试验,牵引速度为15mm/min,定应力2MPa,温度25℃,湿度65%。

    1.7 细胞毒性实验

    1.7.1 浸提液的制备:浸提液介质为生理盐水,按样品质量与浸提液体积比0.2g/ml,在37℃无菌条件下浸提72h,作为材料浸提液。

    1.7.2 细胞培养及分组:采用96孔培养板,各组加入5×103/ml L929小鼠成纤维细胞悬液200μl,37℃、5% CO2培养箱孵育。待细胞贴壁后,分别按照以下分组定期更换培养液(100μl/次):①阴性对照组(n=8),10% FBS+DMEM细胞培养液;②实验1组(n=8),50%材料浸提液;③实验2组(n=8),100%材料浸提液;④阳性对照组(n=8),含0.64%苯酚的10% FBS+DMEM细胞培养液。

    1.7.3 MTT法检测细胞活性:分别于培养24h、48h和72h,按照20μl/孔、加入5mg/ml MTT,37℃、5% CO2下培养4 h;吸出培养液,再加入DMSO 150μl/孔,室温下振荡于结晶物溶解,BIO-RAD Mode680酶标仪波长570nm测定OD值,计算细胞增殖率(RGR)=实验组OD值/阴性对照组OD值×100%。细胞毒性判断标准:0级为≥100%,1级为75%~99%,2级为50%~74%,3级为25~49%,4级为1~24%,5级为0。

    1.8 动物实验

    1.8.1实验分组:①A组:自然愈合组;②B组:生物型人工皮肤组;③C组:生物活性人工皮肤(含20μg bFGF);④D组:生物活性人工皮肤(含100μg bFGF)。

    1.8.2手术过程:兔背部皮肤备皮,全麻成功后,常规消毒铺币,在兔背部皮肤创造4个直径2cm×2cm大小全层皮肤伤口,A、B、C、D组各占一个伤口。其中B、C、D组用丝线将人工皮肤间断缝合在伤口周皮肤上(见图1)。以油纱覆盖伤口,包扎固定,术毕。

    1.8.3术后观察:术后第3天、1周、2周、3周、4周定期观察伤口情况,仔细测量伤口大小。术后1周拆线,术后4周将兔处死,取伤口及愈合组织作病理组织学检查。

    1.9 统计学分析:伤口收缩率各组间进行t检验,P<0.05为有统计学意义。

    2结果

    2.1 生物型人工皮肤的外观及形态学观察:生物型人工皮肤外表洁净、柔软,淡黄色,表面平整,有“毛面”和“光面”。HE染色光镜下见膜片由排列有序的胶原纤维组成,无细胞成分存在(图2)。

    2.2 水蒸汽透过量试验:按标准规定应不低于300g/(m2×24h),测试结果为372±45g/(m2×24h),均符合标准要求。

    2.3 液体吸收量:按标准规定应不低于200%,测试结果为269±38%,均符合标准要求。

    2.4 力学性能测定:最大负荷12.82±2.77N(N=8),抗拉强度1.94±0.42MPa(N=8)。表示材料有一定的韧性。

    2.5 细胞毒性实验:在细胞培养24h、48h、72h的不同时期用倒置显微镜观察,除阳性对照组细胞数量明显减少、细胞固缩甚至崩解外,两实验组与阴性对照组相似,细胞数量明显增加,生长良好。所测OD值见表1,据此计算RGR。实验组RGR在24h、48h、72h均大于90%,而阳性对照组的最大RGR在培养48h时出现,为53%。根据规定,异种材料细胞毒性分级在0~1级,无细胞毒性,可用作生物材料。

    2.6 动物实验

    2.6.1大体观:术后各组创面逐渐愈合,整个观察过程无伤口感染,无动物死亡现象。术后1周,各组皮肤伤口干洁,A组伤口油纱紧贴,B、C、D组伤口人工皮肤紧贴(图3);术后2周,各组创面缩小,A组伤口油纱脱落,B、C、D组伤口人工皮肤仍紧贴;术后3周,各组皮肤伤口明显缩小,表皮再生,表面有大小不等的血痂,B、C、D组伤口人工皮肤已脱落;术后4周,各组皮肤伤口愈合,各别的还有痂未完全脱落(图4)。

    伤口原始大小为4cm2,测量各组皮肤伤口收缩率如图5所示,术后3天及1周时,含bFGF的C和D组,伤口收缩较快。术后3周,B、C、D组伤口收缩明显变小,与A组的差异有统计学意义(P<0.05)。

    2.6.2组织学分析:术后4周,各组皮肤组织中央为瘢痕组织,表面的上皮完全再生,呈鳞状增厚,周边组织呈完全再生,表皮及附属结构完整。其中以A组的瘢痕区域最大,C组的瘢痕区域最小。D组的皮肤组织血管周围水肿,有炎性细胞浸润,瘢痕老化。

    3讨论

    近年各种皮肤替代物在临床上得到广泛的应用,在提高大面积深度烧伤治愈率及后遗畸形矫正等方面做出了突出贡献[3-5]。目前而言,异体皮是一种最理想的皮肤替代物,但却存在几方面不容忽视的缺点:首先是来源受限,其次是具有传播肝炎病毒、HIV的可能,再次是存在排斥问题。另一种临床上应用较为广泛的异种(猪)脱细胞真皮基质同样也存在植入后两周排斥的问题,并且猪皮质地较硬,在创面的贴附性欠佳[6-7]。

    理想的皮肤替代物应具有下有特性:耐用;无抗原性;贴附性好,适合于不规则伤口表面;弹性好;保水性好;防止细菌入侵;促进愈合[8-9]。

    本实验中,我们采用高反应活性环氧化物交联处理动物的膜组织,反应条件温和,聚环氧丙烷可以蛋白质分子形成稳定的交联键,大大提高材料的稳定性,并且由于水溶性好使其容易从样品中清除,无残留毒性 ......

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