他克莫司抑制兔耳瘢痕增生的作用及其机制研究(2)
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参见附件(1764KB，3页)。
1.3.2 标本采集：术后第14、21、28、35及49天每个时间点空气栓塞法随机处死2只兔子，分别沿创面边缘0.5cm处环行切开，切取含创面的兔耳组织，取材后的兔子即退出实验。每个标本沿直径切开，分为两半，其中一半即刻以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，垂直于创面瘢痕最凸起处纵行切片，每张切片厚度为5μm，行苏木素-伊红染色(HE)染色；另一半-80℃冰箱保存备用。
1.3.3 计算瘢痕指数(Scar elevation index，SEI)：光镜下观察HE染色切片，用测微尺测出瘢痕最高点至耳软骨表面的垂直距离取值为a，瘢痕周围正常皮肤至耳软骨表面的垂直距离取值为b，使用公式SEI= a/b，计算出瘢痕增生指数。
1.3.4 Real-time PCR检测：如表1所示设计合成引物，Tm值均设定为60℃。按标本顺序分别切取80mg瘢痕组织，提取总RNA，分光光度计测定RNA浓度，纯化并反转录为cDNA，扩增并检测产物片段大小，-20℃保存。收集所有标本后行Real-time PCR检测纤维化相关因子TGF-β1、TGF-β2及Collagen-α1表达及变化。
1.4 统计学分析：实验结果均以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS11.5软件进行t检验处理数据，P<0.05为差异有统计学意义。
2实验结果
2.1 大体观察：创面在伤后14天时完成上皮化，完全愈合。他克莫司组和对照组创面在上皮化后均逐渐形成不同程度的瘢痕增生，伤后他克莫司组较空白组明显减轻。对照组瘢痕增生明显，色红，质硬，形状不规则，术后21～28天期间，瘢痕增生程度逐渐达到高峰，明显高出皮肤表面，而他克莫司组瘢痕增生不明显，色白，质软(如图2所示)。
2.2HE染色结果：伤后第28天、35天及49天HE染色可见他克莫司组较空白组细胞外基质沉淀较少，其结构较疏松，且成纤维细胞数也明显减少(如图3所示)。
2.3 瘢痕指数(SEI)：术后第21、28、35及49天各时间点他克莫司组瘢痕均比对照组厚度较薄，其SEI差异有统计学意义(图4)。他克莫司组及对照组在术后21～28天时，瘢痕增生程度达到高峰。
2.4 Real-time PCR检测结果：他克莫司对TGF-β1、TGF-β2及Collagen-α1的表达均有明显的抑制作用。空白组中TGF-β1和TGF-β2在伤后第28天达到高峰，而Collagen-α1在伤后21天达到高峰，他克莫司组中表现为各纤维化相关因子总表达总量降低，高峰近似于空白组，其差异P<0.05有统计学意义(如图5～7所示)。
4讨论
瘢痕增生问题一直是整形外科的重要研究领域，机制多种多样，其中免疫因素占有非常重要的作用。皮肤损伤后，首先形成血凝块，作为临时基质而吸引周围炎症细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞进入，共同组成新鲜肉芽创面,继而新血管生成并产生细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)，同时表皮细胞迁移至表面并覆盖表面，成纤维细胞分化成肌纤维母细胞从而形成胶原沉积[6]，多种因子影响并参与[7]。
在创面愈合过程中，早期大量单核细胞浸润，包括巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞、淋巴细胞及浆细胞聚集。其中多种细胞可分泌转化生长因子，而转化生长因子过高表达已被证实与瘢痕形成及增生有关[8]。他克莫司作为临床上常用的免疫抑制剂，可以通过抑制钙调磷酸酶的磷酸酶活性，阻止活化T细胞核转录因子(NF-AT)的去磷酸化和易位，阻止转录形成淋巴因子，同时可以抑制编码IL-3、IL-4、IL-5、GM-CSF和TNF-α的基因的转录，所有这些因子都参与早期阶段的T细胞活化，并影响创面纤维化过程[9-10]，同时他克莫司还可抑制皮肤肥大细胞和嗜碱性粒细胞内已合成介质的释放，据此我们推测，在创面完成上皮化后尽早使用免疫抑制剂，通过抑制肥大细胞、嗜碱性粒细胞介质释放及T细胞活性等，降低IL-4、IL-5及IL-13等因子分泌，从而降低其纤维化相关因子如TGF-β1、TGF-β2及Collagen-α1等表达水平，实现抑制瘢痕增生，达到预防瘢痕增生的目的。
在本实验中，我们通过检测纤维化相关因子TGF-β1、TGF-β2及Collagen-α1的水平发现,他克莫司实验组中TGF-β1、TGF-β2及Collagen-α1含量总体水平较对照组明显降低，可以证实术后创面早期应运免疫抑制剂，可有效预防瘢痕增生，其形态学分析亦可证明，所有实验组较对照组瘢痕增生程度均较低。本实验有助于为增生性瘢痕的形成机制提供更详细的解释，从而为防治瘢痕提供理论依据和新的治疗靶点。
[参考文献]
[1]程飕,付小兵,盛志勇,等. 免疫因素在瘢痕形成和发展中的作用[J].中国临床康复,2002,6(4):472-486.
[2]Traci A. Wilgus. Immune cells in the healing skin wound: Influential players at each stage of repair[J]. Pharmacol Res,2008,58:112-116.
[3]Dumont FJ. FK506, an immunosuppressant targeting calcineurin function[J]. Curr Med Chem,2000,7(7):731.
[4]Morris DE ,Wu I ,Zhao LL ,et al. Acute and chronic animal models for excessivedermal scarring: quantitative studies[J] ......
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