同种异体软骨细胞与自体骨髓基质干细胞混合共培养构建软骨皮下移植的可行性研究(2)
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1材料和方法
1.1 羊软骨细胞的分离和培养：麻醉动物，无菌条件下切取羊耳廓，剥去皮肤及软骨膜，剪成1mm×1mm大小软骨片，磷酸盐缓冲液(PBS) 冲洗两遍，加入5倍体积的1mg/ml II型胶原酶，置于37℃恒温摇床内消化8～12h，100目筛网过滤，离心。沉淀细胞用PBS洗涤2次，以含10% 胎牛血清、L-谷氨酰胺300μg/ml、维生素C 50μg/ml、青、链霉素各100U/ml 的高糖DMEM培养液制成细胞悬液，计数，台盼蓝染色检查软骨细胞活力。以2.7×104个细胞/cm2密度接种于培养皿内，置于37℃、5%CO2 、100%饱和湿度的培养箱中培养，3天后首次更换培养液，以后隔日换液，细胞生长达到90%以上融合时，以0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA(PBS为溶剂)消化收集细胞，可继续传代或直接用于实验。一般以第1代的细胞用于实验。
1.2 羊BMSC的分离和培养：动物常规麻醉、剔毛、消毒、铺巾，肝素化的无菌骨穿针于股骨头附近穿刺，抽取骨髓4～5ml，置于肝素化的无菌离心管中。含标本的离心管中加入无血清DMEM培养液约30ml，混匀制成细胞悬液，1 500rpm离心5min，轻轻吸除脂肪及大部分上清液，重新振荡混匀，以上述方法反复洗涤2次。离心后轻轻吸除大部分上清液，加入10ml含血清培养液，混匀制成细胞悬液；取少量细胞悬液用4%乙酸1:1稀释破坏红细胞，常规计数有核细胞数；以含有10%FBS的低糖DMEM培养液稀释至4×106个有核细胞/ml，按6×105个有核细胞/cm2细胞密度接种于培养皿内。置于37℃、5%CO2、100%饱和湿度的条件下培养4～5天进行首次换液，换液时先轻轻摇动培养皿使未贴壁的红细胞浮起，吸除含大量红细胞的培养液，PBS洗涤2～3次，此时在低倍镜下可清楚地见到多个细胞克隆形成，加入新鲜培养液，继续在相同的条件下培养。3～4天后细胞可达到近融合状态，便可进行传代。一般以第2代的BMSC用于实验。
1.3 PLA-PGA生物支架材料制备：非编制聚羟基乙酸PGA(上海东华大学)。取无纺PGA 20mg，均匀嵌入预制的圆柱形(直径13mm，高2mm)硅胶模具内，添加加压48h，另添加PLA 4mg。75%乙醇浸泡12h，PBS洗涤×3次，含10%血清低糖DMEM预培养过夜，准备接种细胞。
1.4 BMSCs /软骨细胞混合后在PLA-PGA生物支架材料上的体外培养：细胞与PGA/PLA混合的终浓度为5.0×107/ml，下面提到的两种细胞百分比是指终浓度达到这一浓度的百分比。体外培养时间为6周。
1.5 实验分组：A组：100%自体软骨细胞；B组：30%自体软骨细胞+70%自体BMSCs；C组：30%同种异体软骨细胞+70%自体BMSCs；D组：100%同种异体软骨细胞。其中A组与D组分别为阳性对照与阴性对照，B组、C组为实验组。
1.6 羊皮下回植：体外培养6周后，分别将细胞材料复合物植入羊皮下，每个山羊12块(4组，N=3)，采用静脉麻醉，取背部中线作切口，切开至皮下后，用组织剪向两侧游离皮肤，两边各形成一个皮肤“囊袋”，PBS 冲洗构建组织块，洗净培养液后用镊子将组织分别植入囊袋中，间断缝合皮肤。
1.7 体内标本取材时间及观察指标：体内皮下标本12周后取材，分别从直径、湿重及组织学等方面，对所形成的软骨组织进行评价。
1.8 组织化学染色：取材后将标本放入4%多聚甲醛中固定24h，经脱水以及石蜡包埋后，将组织块切成5μm厚切片进行组织学染色，包括常规染色(HE染色)，观察细胞形态和软骨陷窝分布情况。
2结果
2.1 细胞、支架材料及其粘附情况：羊软骨细胞在体外培养呈现出三角形或多角形的外观(图1A)，而羊BMSC呈现出长梭形的成纤维细胞样外观(图1B)。两种细胞与PGA支架材料(图1C)复合后能分泌大量细胞外基质并包裹支架(图1D)。
2.2 复合物体外培养6周情况(组织学)：HE染色发现，单纯软骨细胞组(A和D组)的细胞支架复合物经过体外6周培养，已形成较明显的软骨陷窝样结构，支架材料基本降解(图2A)；共培养组(B和C组)也能形成一定成熟度的软骨陷窝结构，支架材料基本降解(图2B)。
2.3 复合物皮下移植12周情况(大体，湿重，组织学)：经过体外培养6周+羊皮下移植12周后取材发现，A组和B组形成一定强度的瓷白色软骨样组织，较原有支架材料有一定程度的收缩变形(图3A和3B)；C组和D组形成纤维组织样外观，组织充血，质地软，较原有支架材料有较大程度的收缩变形和吸收(图3C和3D)。称湿重发现各组湿重差异明显，A组最重，D组最轻，与大体结果类似(图4)。组织学染色显示：A组形成非常成熟的软骨组织，可见有大量的软骨陷窝和细胞外基质分泌(图5A)；B组形成散在软骨组织，有纤维组织散在其中(图5B)；而C组和D组可见大量淋巴细胞浸润，无软骨组织形成(图5C和5D)。
3讨论
本研究利用少量同种异体羊软骨细胞作为软骨诱导微环境提供者，与扩增后的羊自体BMSC混合共培养并植入皮下环境，拟利用同种异体软骨细胞共培养构建软骨并进行皮下移植。结果显示自体软骨细胞组和自体软骨细胞混合自体BMSC组皮下移植后可见成熟软骨组织形成，但同种异体软骨细胞参与的两组(包括同种异体软骨细胞混合自体BMSC的实验组和单纯异体软骨细胞组)在皮下环境中都因为较强的免疫反应未能形成软骨组织。我们考虑有以下两方面原因：首先，实验组同前两组一样，在移植物周围都存在淋巴细胞侵润，这个可能和皮下移植时组织块中PGA支架材料未完全降解所引起的免疫反应有关；其次，实验组中大量的淋巴细胞浸润，还可能和体外构建的软骨未形成充分的细胞外基质将同种异体软骨细胞包埋有关。因此，在进一步实验中我们设想可以通过以下方法解决以上问题：一、延长体外培养时间，使PGA支架材料充分降解，同时有更多的细胞外基质成分能够将同种异体软骨细胞完全包埋，从而降低同种异体共培养组织工程软骨的免疫原性。二、通过在移植早期对受体羊暂时使用免疫抑制药物，满足抑制早期同种异体移植物免疫排斥反应的发生的要求 ......
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