硒化壳聚糖促创面愈合作用的初步研究(2)
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1.2.4 硒化壳聚糖对细胞生长动力学的影响：取第6代细胞， 5×103个/ml接种于96孔板，每孔接种100μl，培养24h贴壁后按分组加入不同浓度的硒化壳聚糖继续培养，每天消化加药孔和对照孔各3孔细胞计数，计算均值，隔天给未计数的细胞换液并加药，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线，倍增时间计算公式[5]：细胞倍增时间＝培养时间(天)×log2/(log起始细胞数-log培养后细胞数)。
1.2.5 3H-TdR和3H-脯氨酸掺入量测定：取第6代细胞，5×103个/ml接种于96孔板，每孔100μl，培养48h，加入硒化壳聚糖继续培养24h后加入3H-TdR 37M Bq/L或3H-脯氨酸148M Bq/L、维生素C 50mg/L、氨基丙腈，继续培养24h后用0.25%胰酶消化并转移至玻璃纤维滤纸上，液闪计数仪测定每分钟闪烁次数值(counts per minute,cpm)。
1.2.6 LDH漏出率的测定：取第6代细胞，5×103个/ml接种于96孔板，每孔接种100μl,培养48h, 按分组加入不同浓度的硒化壳聚糖继续培养24h，全自动生化分析仪检测上清液中LDH的含量，将培养板中的细胞用0.25%胰酶消化，收集细胞，超声波粉碎后加入PBS液，检测LDH的含量, LDH漏出率的计算公式：漏出率＝(LDH上清液-LDH胞内)/LDH胞内。
1.2.7 统计学处理：数据均以x±s表示，应用SPSS 13.0统计软件进行方差分析。
2结果
2.1硒化壳聚糖对皮肤成纤维细胞增殖的影响：倒置显微镜下可见各组细胞均呈放射状排列，排列规则整齐，胞体较大，生长良好，各浓度组与对照组相比，外观形态未发生明显改变。MTT法检测结果显示各浓度硒化壳聚糖均可使成纤维细胞数量增加，对540nm波长光线吸收增多，50mg/L及以上浓度组吸光度值与空白对照组组比较，差异均有显著性(P<0.05)。从生长曲线来看各浓度硒化壳聚糖组成纤维细胞增殖均比空白对照组明显增快，先于对照组细胞数量达到饱合密度而进入停滞期，随后细胞出现退化死亡，经公式计算可知，200、400mg/L组群体倍增时间分别为(2.80±0.01)和(2.74±0.01)天，与空白对照组的(3.54±0.01)天比较有显著性差异(P<0.01)，其他各浓度组细胞群体倍增时间均比空白对照组有所缩短(见表1)。
2.2 硒化壳聚糖对成纤维细胞DNA、胶原合成和LDH漏出率的影响：各浓度硒化壳聚糖均可促进细胞对3H-TdR的摄入(P<0.05)，400mg/L 组cpm值远高于空白对照组(P<0.01)。100 mg/L及以上浓度硒化壳聚糖可促进细胞对3H-脯氨酸摄入(P<0.05)，400 mg/L组cpm值远高于空白对照组 (P<0.01)。硒化壳聚糖可降低皮肤成纤维细胞LDH漏出率，当浓度大于100mg/L时， LDH漏出率与空白对照组比较差异有显著性 (P<0.05, P<0.01)(表2)。
3讨论
微量元素在人体内含量极低，但却起着很重要的作用，缺乏或者过度增高都会出现生理紊乱[1]。自然界中的硒多为无机硒，存在着不易被细胞吸收，剂量不易控制等缺点，硒化壳聚糖是将海洋生物多糖(壳聚糖)和亚硒酸按一定比例，通过拼合原理制备的有机硒，可有效克服无机硒的上述缺点[6]。已知创面愈合是一个复杂而有序的过程，浅表的损伤主要通过上皮细胞的迁移、增殖来完成，深度损伤的修复则通过肉芽组织的生成来实现[7]，成纤维细胞是肉芽组织的主要组成细胞，本文重点观察了硒化壳聚糖对体外培养的人皮肤成纤维细胞生物学行为的影响，以初步探讨其在创面愈合中的作用。
本实验MTT法检测结果显示硒化壳聚糖能明显促进成纤维细胞增殖，25mg/L浓度作用24h即可使细胞增殖速度加快，浓度越高，效果越明显。经各浓度硒化壳聚糖作用后，处理组比对照组细胞先进入平台期，细胞群体倍增时间也有所缩短。胶原形成是创面愈合过程中重要环节，胶原蛋白含有特有的脯氨酸，且含量相对恒定，可反映胶原的含量[8]。脱氧胸腺嘧啶核苷酸是合成DNA的原料之一，细胞分裂旺盛则DNA合成加快，细胞对脱氧胸腺嘧啶核苷酸的需求量增加。笔者采用3H-脯氨酸和3H-TdR掺入法检测进一步证实了经药物作用后的成纤维细胞分裂和代谢速度加快，这与李晓光[9]等人采用其它方法检测结果一致，说明硒化壳聚糖与单核巨噬细胞集落刺激因子一样均能够促进皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成。
LDH是存在于细胞浆内参与糖酵解反应的酶，如果细胞受损，LDH会由细胞浆中漏出，通过测定培养液中LDH水平可衡量细胞受损的程度，可用于对药物安全性进行评估[10]。本文中硒化壳聚糖非但没有增加LDH的漏出率，相反却能降低LDH漏出率，这与光镜下观察的细胞形态上未出现明显受损改变相一致，说明硒化壳聚糖安全有效且毒副作用较小。
创面愈合主要包括炎症反应、细胞增殖、创面成熟和重建三个阶段，硒化壳聚糖具有硒和多糖的双重抗炎症功效，又能够促进皮肤成纤维细胞增殖，说明硒化壳聚糖至少通过影响这两个阶段发挥促创面愈合的作用。
[参考文献]
[1]颜世铭,洪昭毅,李增禧. 实用元素医学[M]. 郑州:河南医科大学出版社, 1999:25-26.
[2]何丽,张雪,黄君富.等. 67例重度烧伤患者血清铜、锌、锰、硒含量变化与SOD、GSH-PX活性关系的研究[J]. 第三军医大学学报, 2006,28(21):2192-2194.
[3]韩兆峰,王甲汉,李志清,等. 重度烧伤患者中后期肉芽创面多种微量元素的动态变化[J].南方医科大学学报,2008,28(3):505-506.
[4]黎鳌,杨宗诚.实验烧伤外科学[M]. 重庆:重庆大学出版社,1997:268-269.
[5]Tomas P, Vickery Trinkaus-Randall. Regulation of basic fibroblast growth factor binding and activity by cell density and heparan sulfate[J] ......
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