人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建(2)
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1.2人表皮干细胞分离、培养：修剪皮下结缔组织，0.9% NaCl浸泡、清洗3遍，每次5～10min，0.05%醋酸氯已定+0.9% NaCl(1:2，体积比)浸泡5～8min，再次0.9% NaCl浸泡清洗3遍，每次10min，然后将上述组织块置于4℃ Dispase酶(0.25%)浸泡14～16h。以下为两种方法分离人表皮干细胞。
传统方法：取出皮片，0.9% NaCl反复清洗，分离表皮和真皮层，剪碎表皮为1.0mm×1.0mm，加0.25% Trypsin + 0.02% EDTA，37 ℃水浴10min加入含有10% FBS的DEME终止消化。反复吹吸至细胞悬浮，200目筛网过滤，1 000rpm离心5～10min，弃上清，收集细胞，用人表皮干细胞培养基重新悬浮细胞(10ml)，吹打成单细胞悬液，台盼蓝染色。并接种于预先铺有Ⅳ型胶原的25cm2培养瓶内，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育10～15 min后，吸出培养液及未贴壁细胞，PBS洗2次，加入适量新鲜培养基(K-SFM，5ng/ml hEGF，30 μg/ml BPE)继续培养。
改良方法：取出皮片，0.9%氯化钠反复清洗，分离表皮和真皮层，将表皮置于小抗生素瓶后加0.125% Trypsin+ 0.01% EDTA3ml，弯头吸管快速搅拌2min，吸出并加入离心管(已经加有10% FBS的DMEM 1.5ml)中和，再次重复消化一次，吸出后加入另一离心管(已经加有10% FBS的DMEM 1.5ml)中和，将前后两次消化液体合并，离心(1 000rpm，5min)，PBS10ml悬浮细胞，台盼蓝染色鉴定后，再次离心(1000rpm，5min)，表皮干细胞培养基(K-SFM)悬浮细胞，接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶内，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育4～5min后，吸出培养液及未贴壁细胞，PBS洗2次,加入适量新鲜表皮细胞培养基培养(K-SFM，5ng/ml hEGF, 30μg/ml BPE)。
1.3表皮干细胞增殖：将两种方法分离出的hESCs分别作MTT比色试验。两组细胞均以1×105个/孔的密度接种预先铺有Ⅳ型胶原的24孔板内，每24h取3孔做MTT比色实验。根据每天记录的细胞数绘制细胞生长曲线图。
1.4 表皮干细胞鉴定：取二代表皮干细胞培养36 h，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗；0.1%Triton X-100孵育10min；PBS清洗3次，每次5min；3%H2O2去离子水孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶活性；2%山羊血清封闭20 min,加入CK19(1:50稀释)、整合素-β1(1:50稀释)一抗4 ℃过夜；PBS洗5次，滴加生物素化二抗工作液200μl，37℃孵育10min，PBS洗5次；滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液200μl, 37℃孵育10min，PBS洗5次；显色剂显色。
1.5构建组织工程皮肤：以两种不同方法分离、培养的hESCs为种子细胞，鼠尾胶原复合成纤维细胞作为支架材料构建组织工程皮肤。4ml 5×DMEM和14ml胶原于冰上混匀，用1mol/L NaOH调至中性后，加入2mlFBS(含2×106成纤维细胞)混匀，以3ml/孔加入Transwell小室内，放入37℃，5% CO2孵箱培育，待其凝固后加入10% FBS的DMEM，继续培养，24h后将2代hESCs以3×106/孔种植于鼠尾胶原表面，气-液面培养1周。
1.6 统计学分析：采用SPSS11.0软件进行统计处理，实验数据以x±s表示，两组间均数比较行两样本t的方差分析， P<0.05为差异有显著性意义。
2结果
2.1 改良消化法和传统消化法细胞消化效率的比较：将同一块包皮组织等份分开，用两种方法同时分离表皮细胞，台盼蓝染色、细胞计数(总体积均为10ml)，实验独立重复5次。
2.2改良法和传统法分离细胞形态学比较：采用Ⅳ型胶原粘附法分选表皮干细胞，改良法较传统法粘附细胞密度大，4h后大部分细胞贴壁良好，镜下可见细胞胞体小，核质比大，呈三角形或多边形。接种后第二天培养基中存在一定数量的漂浮细胞，但改良法漂浮细胞数明显少(图2)。3天后，有部分细胞形成较小克隆，胞体紧密相靠，胞膜互相衔接，呈典型“铺路石样”生长。
2.3改良法和传统法细胞增殖比较：两组细胞在第2天细胞数量有所下降，均在第4天时进入对数生长期，改良法细胞在对数期呈明显上升趋势，于第7天到达平台期，镜下观察细胞融合；传统法细胞对数期上升缓慢，第8天时细胞仍未融合。由此表明出改良法细胞活性较好生长较快(图3)。
2.4改良法和传统法分离细胞的鉴定天对采用两种方法培养的hESCs行K19、β1整合素免疫染色，结果显示，95%以上细胞K19、β1整合素均呈阳性表达(图4)，且两种方获得的表皮干细胞生物学特性无显著差异。
2.5 改良法和传统法分离的细胞构建组织工程皮肤组织学比较：两种方法分离培养的hESCs分别构建出的组织工程皮肤均呈3层：由下到上为真皮层、表皮层、角质层。改良法细胞构建的组织工程皮肤表皮层厚，约5～6层，表皮和真皮交接处可见细胞排列整齐，形似基底细胞。传统法细胞构建的组织工程皮肤表皮层较薄，约3～4层，表皮真皮交接处未见类似基底细胞(图5)。
3 讨论
hESCs是皮肤组织的特异性干细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能。是皮肤发生、修复、重塑的关键性源泉[5]，以其作为种子细胞构建组织工程皮肤，可获得与生理皮肤相类似的组织结构。临床上大面积较深度烧伤往往导致表皮、真皮的损伤缺失，近年来，利用含有hESCs的组织工程皮肤覆盖创面取得一定的效果，而在其构建的过程中表皮干细胞的分离培养是必须面对的问题。
传统的方法中表皮层与真皮层分离后，用剪刀剪碎成1.0mm×1.0mm大小后进行胰蛋白酶消化，减碎的过程中暴露在组织边缘的细胞增多，而剪刀的挤压可对组织造成挤压损伤[6]，导致部分细胞壁损害进而细胞活力下降或死亡，在改良的方法中 ......
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