ALA-PDT对兔耳增生性瘢痕抑制效应及作用机制的初步研究(2)
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1.2.2 处理过程：剪大小约1.2cm的圆形医用棉，覆盖于创面，将配好的5-氨基酮戊酸药液浸湿医用棉，再用保鲜膜贴在医用棉上，垫上纱布，覆盖上黑色塑料纸，最后医用胶布粘贴封包，3h后进行激光照射。
1.2.3 光照条件：采用XD-635AB型光动力激光治疗仪，为半导体激光，波长635nm，总输出能量180.30J，输出能量密度 229.60 J/cm2，输出功率 300mW，监测功率300mW，光斑大小 1cm，光照时间10min/创面。
1.3标本取材及处理：兔耳腹侧创面形成术后28天，麻醉方法同前，用手术刀切取兔耳全层，周边带有少许正常组织，4%甲醛溶液固定24h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，常规切片，5μm 厚度，进行HE、masson胶原染色及TGF-β1免疫组化。
1.4观察指标
1.4.1瘢痕形成率：瘢痕组织高出皮面〉2mm，硬度与兔耳软骨相似时即为增生性瘢痕。
1.4.2瘢痕增生指数(Hypertrophic Index,HI)：HE染色组织切片于低倍镜下用测微尺测量 ,按公式HI=A/B计算瘢痕增生指数。A=瘢痕凸起最高点至耳软骨表面的垂直高度；B=瘢痕周边正常皮肤皮缘至耳软骨表面的垂直高度。
1.4.3 Masson胶原染色：每张切片中随机选5个视野，以蓝色为阳性，利用图像分析系统，分析胶原纤维的含量。
1.4.4免疫组化TGF-β1结果判断标准：TGF-β1着色强度分级：其阳性表达为棕黄色颗粒状，定位于细胞浆。每例标本选取5个高倍镜视野计数，采用盲法进行图像分析，将观察材料分成4 组：染色细胞数少于细胞总数的10%为(-)；细胞胞浆着色为浅黄色，染色细胞数占细胞总数的10%～30% 为(+)；细胞胞浆着色为棕黄色，染色细胞数占细胞总数的30%～60%为(++)；细胞胞浆着色为深棕色，染色细胞数占细胞总数的60% 以上为(+++)。
1.4统计分析：本研究的结果数据应用SPSS 13.0统计软件进行分析，显著性水准取双侧，α=0.05。瘢痕形成率的差异使用卡方检验，瘢痕增生指数及胶原纤维含量数据使用方差分析，免疫组化TGF-β1数据使用秩和检验分析。
2结果
2.1大体观察结果：对照组创面愈合区组织明显高于周围正常皮肤，表现为瘢痕中央呈乳头状突起，呈淡红色，质韧，增生块高出皮面，其增生范围不超过原有创缘。ALA-PDT组愈合区略高于正常皮肤，色泽较淡。
2.2 HE染色结果：对照组皮肤组织镜下显示：真皮层明显变厚 ,为周边正常真皮层厚度的 3～4倍,其间有炎性细胞浸润及毛细血管扩张。治疗组真皮层厚度约为正常真皮层厚度的1.5～2倍(见图1)。
2.3 Masson胶原纤维染色结果：胶原纤维呈蓝色。对照组真皮层可见大量排列紧密，紊乱粗大的深蓝色胶原纤维，可见大量梭形成纤维细胞。治疗组真皮层蓝色胶原纤维染色相对淡浅，排列稀疏整齐，成纤维细胞数量减少(见图2)。经图像分析对胶原纤维进行半定量分析，结果见表1。
2.4结果分析：(瘢痕形成率、瘢痕增生指数、胶原纤维含量、免疫组化TGF-β1表达情况详见表1，表2、图3。)
ALA-PDT治疗降低了瘢痕形成率，瘢痕形成率经卡方检验，三组之间不完全相等(χ2=11.400，P=0.003，P<0.01)。其中药物高浓度ALA-PDT组与对照组的差异有统计学意义(χ2=10.989，P=0.001，P<0.01)。药物低浓度ALA-PDT组与对照组之间无显著差异(χ2=2.500，P=0.114，P>0.05)。药物高浓度ALA-PDT组与低浓度ALA-PDT组之间无显著性差异(χ2=3.636，P=0.057，P>0.05)。
三组瘢痕增生指数经方差分析(F=17.266，P=0.000，P<0.001)。药物高浓度ALA-PDT组和药物低浓度ALA-PDT组的瘢痕增生指数与对照组间差异均具有统计学意义(F值分别为15.320和10.765；P值分别为0.009和0.046，P<0.05)。药物高浓度ALA-PDT组和药物低浓度ALA-PDT组的瘢痕增生指数差异无统计学意义(F=5.037,P=0.098,P>0.05)。
三组胶原纤维含量经方差分析(F=35.561，P=0.000，P<0.001)。药物高浓度ALA-PDT组和药物低浓度ALA-PDT组的胶原纤维含量与对照组间差异均具有统计学意义(F值分别为32.221和23.426；P值分别为0.002和0.037，P<0.05)。药物高浓度ALA-PDT组和药物低浓度ALA-PDT组之间胶原纤维含量无显著的差异(F=4.327,P=0.065，P>0.05)。
三组TGF-β1的表达数据经秩和检验(Hc=8.562，P=0.014，P<0.05)。 药物高浓度与低浓度治疗组之间无显著性差异(Hc=1.446，P=0.148，P>0.05)。药物低浓度治疗组与对照组之间无显著差异(Hc=1.446，P=0.148，P>0.05)。药物高浓度治疗组与对照组之间有显著性差异(Hc=2.932，P=0.003，P<0.01)。
3讨论
增生性瘢痕是皮肤对创伤、烧伤、炎症或自行发生的一种皮肤纤维过度增生性疾病，其发生机制是由细胞因子、微循环、免疫、基因表达、细胞的增殖和凋亡、胶原的代谢和排列等多种因素共同作用的结果[1]。目前尚无理想的治疗方法。因而对增生性瘢痕采取预防措施显得尤其重要。
ALA-PDT已在皮肤科领域逐渐得到越来越多地应用，尤其是在皮肤病毒疣及皮肤肿瘤方面取得了较好的疗效。其治疗原理为肿瘤组织或增生活跃的细胞选择性吸收ALA后，在细胞内转化为高度光敏性物质PPⅨ(原卟啉IX 等卟啉类物质)，经红光照射产生光化学反应，生成大量活性氧，活性氧与多种生物大分子相互作用，损伤细胞结构或功能，从而达到治疗目的。蔡宏[2]等研究报道，在瘢痕形成早期，血卟啉单甲醚(HMME)- 光动力疗法(PDT)能够抑制兔耳瘢痕成纤维细胞的增殖能力，破坏前胶原蛋白合成的场所，减少胶原蛋白的合成与分泌，并能诱导部分成纤维细胞进入凋亡途径 ......
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