黄芪甲苷对紫外线诱导皮肤成纤维细胞表达TGFβRⅡ与Smad7的影响(2)
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1.2 原代人成纤维细胞培养：取健康儿童环切包皮，利用细胞培养法，加入含20%小牛血清的DMEM培养液，待成纤维细胞融合至80%～90%时消化传代，实验选用3～8代细胞。
1.3 药物的配置：取0.05g黄芪甲苷干粉溶于0.5ml二甲基亚砜 ( DMSO)， 配成浓度为100mg/ml的贮存液，-20℃保存，临用时用DMEM 培养液倍比稀释，使其终浓度分别为3、5、10、20、30、40、45、50μg/ml。
1.4 MTT法测细胞增殖活性及药物最适浓度：制备单细胞悬液，接种于96孔板中，等细胞贴壁生长至70%～80%时，加入不同浓度的黄芪甲苷，培养24h后换回无药物的培养基， 再向每孔(含100μl培养基)加入20μl浓度为5mg/ml的 MTT，孵育 4h，弃上清，加入150μl DMSO，置恒温振荡器内振荡10min，酶标仪测定各孔在490nm处吸光值(A值)，计算细胞活性以及选取最佳药物浓度。每种药物浓度4个复孔，重复3次试验。
1.5紫外线照射及实验分组：将细胞接种在直径10cm的培养皿中，用含10%FBS的DMEM培养液于37℃、5%CO2温箱孵育，待细胞生长至80%～90%时进行实验。实验分5组，A组 (正常对照组)：未经任何处理； B组(UVA照射组)；C组(UVB照射组)；D组(As+UVA组)：用黄芪甲苷孵育2h，弃去，PBS洗1次，再以UVA照射，照射后继续以含黄芪甲苷的DMEM培养；E组(As+UVB组)：用黄芪甲苷孵育2h，弃去，PBS洗1次，再以UVB照射，照射后继续以含黄芪甲苷的DMEM培养；以上加药组均以浓度为40μg/ml(经MTT所测得药物最适浓度)的黄芪甲苷处理，B组、D组以10J/cm2的UVA照射，C组、E组以30mJ/cm2的UVB照射，照光后各组均加入相应的无血清DMEM培养基继续培养24h后，收集细胞上清液用于ELISA，细胞用做RT-PCR及Western blot。
1.6 ELISA法检测细胞上清Smad7分泌量：加入黄芪甲苷干预24h后，收集上清液。严格按照试剂说明书进行。
1.7 半定量RT-PCR测定细胞TGFβRⅡ和Smad7mRNA表达变化：细胞总RNA提取严格按trizol提取液说明书进行，按照相应的PCR试剂盒逆转录合成cDNA；按以下引物进行RT-PCR扩增：
Smad7引物(301bp)
F-primer 5' -CCT CCT TAC TCC AGA TAC CCA -3'
R-primer 5' -GCT GAC TCT TGT TGT CCG AAT -3'TGFβRⅡ引物(81bp)
F-primer 5'-CTG CGT CTG GAC CCT ACT CTG T-3'
R-primer5'-TTC TGG AGC CAT GTA TCT TGC A-3'
β-actin做内参照引物(271bp)
F-primer 5'-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GGC-3'
R-primer 5'-CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC-3'
扩增条件：预变性94℃5min； 变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，循环35次；最后72℃7min延伸。最后取 PCR产物l0μl在2%琼脂糖凝胶中电泳，紫外凝胶成像系统扫描成像。
1.8 Western blot检测TGFβRⅡ的蛋白水平：于照光加药后24h收集各实验组细胞，以M- PERTM (Pierce)蛋白提取液分别处理细胞，收集细胞总蛋白，BCA法定量后经 SDS-PAGE，电转膜，免疫抗体反应，最后化学增强发光法(ECL)显带。
1.9 统计学处理：数据以(x±s)表示，用SPSS13.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析，P<0.05有显著性差异。
2结果
2.1 黄芪甲苷对成纤维细胞增殖活性的影响：不同浓度黄芪甲苷干预后，结果显示：细胞活性随黄芪甲苷的浓度增加而增强，与正常对照组相比，药物浓度为40μg/ml时差异最显著(P﹤0.05)，见图1。
2.2 黄芪甲苷对成纤维细胞细胞上清液中Smad7含量的影响：表1结果显示：UV照射组Smad7蛋白含量明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P﹤0.05)，黄芪甲苷处理后，Smad7蛋白含量明显下降，与UV照射组相比差异显著(P﹤0.05)。(表1)。
2.3 黄芪甲苷对成纤维细胞TGFβRⅡ、Smad7mRNA表达的影响：结果如表2所示： UV组，TGFβRⅡmRNA相对表达量明显低于正常对照组，而Smad7 mRNA的相对表达量明显增高，与正常组相比有显著性差异(P﹤0.05)， 黄芪甲苷处理后， 细胞TGFβRⅡmRNA的相对表达量升高， Smad7mRNA的相对表达量明显降低，与UV组相比差异有统计学意义(P﹥0.05)(表2、图2、图3)。
2.4 黄芪甲苷对成纤维细胞TGFβRⅡ蛋白表达的影响：如图4b所示，UVA(10J/cm2)及UVB(30J/cm2)辐射的成纤维细胞(设为D组及E组)与正常培养的细胞相比，其TGFβRⅡ/β-actin比值降低，加入黄芪甲苷后TGFβRⅡ/β-actin比值增高，分别为D组的1.66倍，为E组的1.67倍，且与相应的UV组相比差异均有显著性(P<0.05)。见图4。
3讨论
成纤维细胞是真皮的主要功能细胞和结构基础，也是紫外线辐射的重要靶位之一， 经UV辐射后，不仅可使成纤维细胞的增殖活性降低，还可使细胞内一系列的信号传导出现异常，胶原蛋白合成减少，最终导致皮肤光老化。
转化生长因子-β(TGF-β)是一多功能的细胞生长调节蛋白。TGF-β可促进成纤维细胞增殖，使其合成胶原等细胞外基质成分的能力增强[5]。TGF-β超家族受体主要有Ⅰ型( TGFβRⅠ)和Ⅱ型(TGFβRⅡ)，都属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶跨膜受体。TGF-β的Ⅱ型受体(TGFβRⅡ)与TGF-β的Ⅰ型受体(TβRI)形成异源受体复合物一起介导TGF-β在细胞内的信号转导[6]。Smad蛋白被认为是介导TGF-β信号进入细胞核内的最重要的信号分子；Smad家族中Smad7对TGF-β/Smads途经的信号转导起负性调节作用[7]。TaiHao Quan等研究表明，UV 辐射成纤维细胞可下调TGFβRⅡ，影响对TGF-β的效应能力，干扰TGF-β依赖的I型前胶原基因表达以及蛋白的合成[2-8]，并能诱导Smad7在皮肤内表达 ......
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