供者未成熟树突状细胞联合西罗莫司诱导大鼠皮肤移植物免疫耐受研究(2)
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1.3 大鼠异体皮肤移植模型：以BN大鼠为供体，LEW 大鼠为受体。供体腹腔内注射50mg/kg戊巴比妥钠麻醉，于其躯干背部以剪去全层皮肤一块，刮尽皮肌，修剪成中厚皮，制成直径1cm的圆形皮片，修剪成中厚皮；受体同样方法麻醉后，背部胸腹交界处剃毛，皮肤消毒，用眼科剪刀以钳夹法剪去全层皮肤一块，形成约1cm2的圆形创面，勿伤及皮肌。将供者皮肤贴于创面处，间断缝合皮肤边缘，打包包扎，注意移植皮片毛的方向与受者毛的方向相反。5天后打开包扎，观察皮片的存活情况，皮片变黑坏死脱落或全部形成干痂为皮片死亡。移植术前对LEW大鼠肌肉注射青霉素钠2万U/kg；术后再注射1万U/kg，2次/天，共3天。
1.4 实验分组设计：随机将32只LEW 受体大鼠分为4组(每组8只)，32只BN供体大鼠分为4组(每组8只，对应分配于3组受体移植大鼠)。①对照(control)组：术前不给予任何干预措施；②未成熟树突状细胞(imDCs)组：于术前7天经尾静脉注射供者骨髓来源的imDCs 2×106个/只；③西罗莫司(SRL)组：于术后连续7天经胃管灌注SRL 3mg.kg-1.d-1；④联合(imDCs+SRL)组：使用imDCs于术前7天经尾静脉注射，术后连续7天经胃管灌注SRL，用法同imDCs组及SRL组。
1.5 移植皮片病理学观察及排斥反应分级：于移植术后第7天分别取各组大鼠的移植皮片，用40g/L的多聚甲醛液固定，常规石蜡包埋组织，切片后HE染色，光镜下观察皮片病理变化。镜下皮片的排斥反应分级参照文献[9]的分级标准。
1.6 统计学方法：采用统计学软件SPSS 13.0，以方差分析检验各组均数问的差异，如果差异有统计学意义，S-N-K检验进一步行多重比较。
2结果
2.1 未成熟DC形态学检测：未成熟DC培养24h后，光镜下可见贴壁的单核细胞均匀分布。3天后大量的细胞疏松的贴附于板壁上呈簇状生长。5天后细胞集落增多，呈悬浮生长，细胞形态不规则，表面有星状毛刺疏松粘附细胞即为未成熟DC。
2.2 移植皮片病理学观察：各组移植术后第7天移植物排斥反应分级。①对照(control)组：镜下观察，移植皮片表皮层断裂，腺体结构消失，大量炎性细胞浸润，分级为Ⅳ级；②未成熟树突状细胞(imDCs)组和西罗莫司(SRL)组：移植皮片皮下组织有出血，腺体结构不完整，但炎症细胞浸润较对照组明显减轻，分级为Ⅲ级；③联合(imDCs+SRL)组：皮片各层结构及皮肤附属器形态完整，少量炎性细胞浸润，分级为Ⅱ级。联合使用imDCs及SRL可降低移植物排斥反应等级。
2.3 各组移植皮片生存时间(见表1):各组间差异具有统计学意义。control组8天左右移植皮片完全坏死脱落，imDCs组以及SRL组情况相似，7天左右皮肤出现局部溃疡，10天左右移植皮片完全坏死，而imDCs+SRL组在7天时皮片成活较好，在2周左右皮片出现溃疡，在3周左右移植皮片才形成干痂、坏死脱落。对照组与imDCs组、SRL组和imDCs+SRL组的移植皮片生存时间存在显著差异(P<0.05)；imDCs组与SRL组的移植皮片生存时间无显著差异(P=0.74)；imDCs+SRL组与imDCs组、SRL组的移植皮片生存时间存在显著差异(P<0.05)。以上数据说明未成熟DC联合应用SRL可显著延长移植皮片的存活时间。
3讨论
皮肤移植后的免疫排斥反应是典型的细胞性排斥反应，成熟DC表面表达丰富的MHC分子和辅助刺激因子，能有效地递呈抗原并激活T细胞发生免疫应答，而未成熟DC表面高表达MHC分子，低表达辅助刺激分子，缺乏启动T细胞应答的功能。由于未成熟DC这一特点，在诱导免疫耐受、延长移植物存活时间中应用[10]。目前已有动物试验证实，未成熟DC的输注能在一定程度上延长移植物的存活时间，但单独应用未成熟DC的效果尚不能令人满意，主要由于未成熟DC由于表面缺乏协同刺激因子即T细胞活化的第二信号而引起T细胞特异性无应答，但在摄取抗原后，或受到某些炎性细胞因子(如TNF-a)或某些细菌成分(如LPS)的刺激后，细胞表型迅速发生变化，表达高水平的协同刺激分子CD40和CD86，进入成熟状态，失去耐受原作用进而诱发免疫应答反应 [11-12]。因此，如何使DC稳定地保持不成熟状态是诱导免疫耐受的关键，而有关SRL的研究为解决这个难题提供了新的思路。
SRL为第三代免疫抑制剂，具有较强的抗移植排斥作用，且副作用明显低于环孢素A，目前国内外均已将SRL应用于临床器官移植术后患者。SRL的作用机制是通过与细胞内受体FK506结合蛋白12(FKBP12)结合，抑制丝氨酸/苏氨酸激酶哺乳动物西罗莫司靶蛋白(mTOR)的功能，从而阻断细胞因子受体的信号转导过程，阻止淋巴细胞从G 期进入S期，即抑制淋巴细胞在细胞因子诱导下的克隆增殖[13]。另一项研究则发现，此类药物可抑制DC表面IL-18Rα和β的表达，从而减少IL-12的自分泌；同时通过阻断Jak2/Stat4信号途径阻止IL-12对自身IL-12R的激活，明显抑制Dc的功能[14]。另外此类药物还可以增加反应性T细胞对CD8+否决细胞的易感性，促进后者引发的T细胞凋亡[15-16]。西罗莫司也在体外可部分改善创伤小鼠DC功能,并提高其诱导T淋巴细胞的应答能力[17]。所以，如果能将未成熟DC与SRL结合起来，将有可能成为一种相对简便、经济的诱导免疫耐受的方案。国外文献报道，与环孢素A及FK506常规免疫抑制剂相比，SRL与抗CD45RB、抗CD154等单克隆抗体具有更好的协同作用，联合应用时可明显提高受者对移植物的接纳率并易于诱导嵌合体形成[18-19]。但目前对于未成熟DC联合SRL在诱导大鼠移植免疫耐受中的作用尚无报道。
本实验我们选择了大鼠皮肤移植模型，皮肤移植与心、肾等实质器官移植相比，具有排斥反应更强烈、诱导耐受更困难的特点。用供体未成熟DC预处理受者，1天后行异体皮肤移植术，在移植术后未应用任何免疫抑制措施的前提下，移植皮肤存活时间延长，说明供体未成熟DC可在体内诱导一定程度的免疫耐受。术后联合使用SRL可使大鼠皮肤移植物的存活时间进一步延长 ......
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