6-O-羧甲基壳聚糖对人增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1表达的影响(2)
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1.3HSFBs的原代及传代培养：称取手术切除的增生性瘢痕组织块约5g，去除表皮及皮下脂肪，在无菌条件下漂洗、消毒，留白色质韧真皮胶原组织备用。原代培养采用组织块培养法，具体方法参照文献[5-6]进行，待细胞融合至80%时，常规消化、传代。实验选用第3～5代细胞。
1.46-O-CMC对HSFBs生长及形态的影响：以2×105个/ml的细胞密度分别接种于24孔培养板，每孔1ml，37℃、5%CO2培养箱中培养12h后，按分组加入不同浓度的培养液，继续培养24h，在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。
1.5 ELISA法测定TGF-β1蛋白表达水平：以1×106个/ml的细胞密度分别接种于6孔培养板，每孔2ml，37℃、5%CO2培养箱中培养12h后，按分组加入不同浓度的培养液。继续培养48h后收集培养上清。双抗体夹心ELISA法检测TGF-β1蛋白水平，严格按照试剂盒说明书测定吸光度并绘制标准曲线。
1.6 引物设计与合成(上海生工生物技术有限公司完成)：
TGF-β1：上游引物：5'-ACCGGCCTTTCCTGCTTCT-3'；下游引物：5'-GGTCCTTGCGGAAGTCAATGT-3'；产物长度：156bp。
内参β-actin：上游引物：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'；下游引物：5' -CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'；产物长度：205bp。
1.7 总RNA的提取：以1×106个/ml的细胞密度分别接种于6孔培养板，每孔2ml，37℃、5%CO2培养箱中培养12h后，按分组加入不同浓度的培养液。继续培养48h ，应用Trizol试剂盒提取的总RNA(方法按说明书进行)；并用紫外分光光度计定量，A260/A280值≥1.8的进入下一步实验。
1.8 荧光定量PCR 扩增：逆转录反应(合成cDNA)严格按照试剂盒操作说明进行；PCR 扩增反应体系(20μl) ：SYBR Premix Ex Taq II(10μl)，PCR Forward Primer (0.8μl)， PCR Reverse Primer(0.8μl)， dH2O (6.4μl)， cDNA (2μl)。反应条件：95℃30s，95℃5s， 60℃45s，共40 个循环。
以β-actin为内参照，采用相对定量法，利用Ct值计算TGF-β1mRNA 的相对量。
用荧光定量PCR常用公式进行运算：
相对表达量=2-△△Ct
其中：△△Ct=[CT(待测基因)-CT(待测组β-actin)]-[CT(对照基因)-CT(对照组β-actin)]
1.9统计学方法：数据用SPSS 18.0 统计软件处理，计量资料用表示；所有浓度组之间运用单因素方差分析进行比较，各组间两两比较采用最小显著性差异法(Least Significant Difference，LSD法)，P<0.05 表示有统计学意义。
2结果
2.1 6-O-CMC 对HSFBs生长及形态的影响：空白组细胞多呈典型的长梭形，胞体较大，胞浆丰富，生长旺盛，连接紧密，走向趋于一致，偶有有交叉重叠。药物组，随着6-O-CMC浓度的升高，细胞间出现空隙并逐渐扩大，胞体变小，梭状突起回缩，细胞双极变得尖细，部分细胞呈单极或不规则形态生长，部分细胞脱落，悬浮于培养液(图1)。
2.2 ELISA测定TGF-β1蛋白表达水平：与空白组相比，各药物组TGF-β1蛋白表达量均降低(P<0.05)，药物浓度越高，表达量越低(P<0.05)(图2，表2)。
2.3 荧光强度曲线：荧光PCR仪在扩增过程中，会自动记录每个循环的荧光强度。在最佳实验条件，相同扩增效率的前提下，反应体系产生一定强度的荧光信号所需的扩增循环数(Ct 值)与反应体系中的原始模板数(cDNA)成反比。通过对荧光信号及扩增进程的实时监测, 以荧光强度与循环数建立坐标, 标本呈现典型的S 形曲线(图3)。
2.4 初始cDNA相对量：根据荧光强度曲线中的Ct值，由上述公式算出初始cDNA 的相对量多少，即可代表原始TGF-β1 mRNA表达量多少。 结果显示，与空白组相比，各药物组TGF-β1 mRNA的表达量均减少(P<0.05)，且药物浓度越高，表达量越低(表1)(P<0.05)。
3讨论
病理性瘢痕的防治一直是整形外科的难题之一。目前，主要应用药物局部注射治疗。治疗药物主要包括皮质激素类药、抗肿瘤药、免疫调节类药物和中药制剂等。但是，这些药物的毒副作用较大，难以在临床广泛应用。所以，在天然产物中寻找药理作用明确且无明显毒副作用的活性单体，一直是目前研究的热点。
壳聚糖(chitosan)是地球上蕴藏量仅次于纤维素的天然高分子化合物， 是目前已知的天然多糖中唯一的碱性多糖，它具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒及抗菌性等特点，在生物医学领域的应用日益广泛[7-8]。6-O-CMC是壳聚糖经羧甲基化而得的一种水溶性多糖，与壳聚糖相比，其水溶性明显提高, 在医药方面的用途更加广泛[9]。研究表明羧甲基壳多糖对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成有抑制作用[10]，对角质细胞生长有促进作用[11]。6-O-CMC局部注射对兔耳增生性瘢痕的抑制作用与曲安奈德相近，局部注射能够抑制兔耳增生性瘢痕[12]。这些均提示羧甲基壳聚糖在瘢痕治疗领域有广阔前景。
本实验基于以上研究，着眼于进一步探究6-O-CMC发挥抑制增生性瘢痕作用的机制。选择TGF-β1为检测指标，因其为HS发生发展的重要调节因子。它在HS组织中的表达与正常皮肤组织和正常术后瘢痕组织相比具有显著差异，并在HS发展的早期阶段起着关键性作用[13]。实验以体外培养的人HSFBs为靶细胞，采用ELISE及荧光定量RT-PCR技术检测不同浓度6-O-CMC对TGF-β1蛋白及 mRNA表达的影响 ......
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