不同浓度乙醇对大鼠肌肉组织影响的探讨(2)
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1.5 HE 染色切片分析：测量体积后切取注射部位腓肠肌组织，10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肌细胞结构、肌膜、肌纤维及细胞核的变化。
1.6 统计方法：采用SPSS13.O统计分析系统，所有数据结果均用均数士标准差(x±s)表示，用方差分析做组间比较及各时间点间比较，P<0.05差异有统计学意义。
2实验结果
2.1 实验动物大体观察结果：注射乙醇后，大鼠后肢活动频率和幅度均有不同程度减少，以术后3～4日最为明显，其中D组、E组后肢活动减少程度较A组、B组、C组明显。所有实验动物未见明显活动及觅食障碍。活体切取腓肠肌，与自身对照侧相比，实验侧肌肉组织颜色苍白、弹性降低，质地变硬。
2.2 腓肠肌收缩力ΔF：分别于注射不同浓度乙醇术后，第3、7、14、21、28天在活体状态下手术分离出两侧腓肠肌，通过肌张力转换器，测量其每侧收缩力，通过计算得出两侧变化值。 结果显示：不同的处理组间P=0.000，不同的乙醇浓度对腓肠肌收缩力ΔF的影响差异有统计学意义；D组与E组间P=0.993，80%与90%乙醇浓度对腓肠肌ΔF的变化差异无统计学意义。不同的时间手术分离组间P=0.000，说明时间对腓肠肌收缩力ΔF的影响差异有统计学意义；21天与28天组间P=0.933,第21天与28天手术对腓肠肌ΔF的变化差异无统计学意义(表1)。
实验侧/自身对照收缩力，即为腓肠肌收缩力变化百分率，由各实验组不同时间的腓肠肌收缩力改变可作出腓肠肌收缩力变化趋势见图，见图1。
通过观察大鼠腓肠肌ΔF，了解肌肉收缩力的变化，可进一步反映出腓肠肌功能的变化情况。随乙醇浓度的增加A-D组实验侧肌肉收缩力减弱，表明不同浓度(50%～80%)乙醇可以导致肌肉收缩力变化不同，随着浓度升高，收缩力降低，D组与E组之间ΔF没有显著差异，表明注射超过80%浓度乙醇腓肠肌基本纤维化；第21与第30天各组腓肠肌收缩力ΔF相比没有显著差异，表明注射乙醇21天后，腓肠肌组织纤维化程度基本稳定。
2.3、腓肠肌体积ΔV：分别于注射不同浓度乙醇术后，第3、7、14、21、28天在活体状态下手术切取大鼠两侧腓肠肌，待测量完收缩力后，迅速用量筒测量其体积，通过计算得出两侧腓肠肌体积变化ΔV。结果显示：不同的处理组间P=0.000，不同的乙醇浓度对腓肠肌体积ΔV的影响差异有统计学意义；D组与E组间P=0.968，80%与90%乙醇浓度对腓肠肌体积ΔV的变化差异无统计学意义。不同的时间手术分离组间P=0.000，说明时间对腓肠肌体积ΔV的影响差异有统计学意义；21天与28天组间P=0.939,第21天与28天手术对腓肠肌体积ΔV的变化差异无统计学意义(表2)。
实验侧/自身对照体积，即为腓肠肌体积变化百分率，由各实验组不同时间的腓肠肌体积改变可作出变化趋势图，见图2。
由腓肠肌体积变化趋势图可见：在同一乙醇浓度下，随着时间延长，腓肠肌体积逐渐缩小，第21天后，体积变化不明显。一周以后，随着注射乙醇浓度升高，腓肠肌体积变化增大，乙醇浓度超过80%，腓肠肌体积变化不明显。
2.4 组织学观察：腓肠肌组织HE染色，光镜下可见：
2.4.1 空白组/自身对照侧：肌细胞显红色，肌细胞核位于细胞周边肌膜下，显蓝褐色。常态下肌细胞排列整齐、大小规则，肌节完整可见(图3)。
2.4.2 A组(50%乙醇)：肌细胞排列整齐，肌纤维变细，肌膜完整，肌间隙稍变宽，细胞核可见(图4)。
2.4.3 B组(60%乙醇)：肌细胞排列、形态稍絮乱，肌纤维少许断裂、纤维化，肌膜不完整，肌间隙变宽，细胞核可见(图5)。
2.4.4 C组(70%乙醇)：肌细胞排列絮乱，形态不规则，肌纤维断裂、纤维化明显，肌膜被破坏，肌间隙较宽，细胞核可见(图6)。
2.4.5 D组(80%乙醇)：肌细胞结构完全破坏，呈坏死状态，继之坏死区纤维机化，肌膜完全被破坏，细胞核碎裂消失(图7)。
2.4.6E组(90%乙醇)：肌细胞结构完全破坏，成纤维化，肌膜完全被破坏，肌纤维断裂、溶解，细胞核碎裂消失(图8)。
3讨论
高浓度乙醇局部注射可以使受注射部位组织细胞脱水、蛋白质发生凝固性坏死，产生无菌性炎症，进一步会发生纤维化和挛缩。自1983年日本杉浦倍之首先采用超声引导下经皮肝穿刺肿瘤内注入无水酒精疗法(PEI)治疗肝癌以来。国内外已逐步将无水乙醇应用于临床上，用于治疗肝血管瘤[2]、肝囊肿[3]、肾囊肿[4]、消化道出血[5]以及海绵状血管瘤[6]等疾病。由于灌注无水乙醇后，一些不可控因素，常导致周围正常组织的变性坏死，从而限制乙醇在临床上的广泛应用。
肌肉内血管瘤(IMH)是位于肌内呈弥漫性生长的血管瘤，比较少见，约占海绵状血管瘤的0.8%[7],常见于四肢，其次为面部及躯干[7]，多同时侵犯皮下[10]、肌肉组织，甚至侵犯至骨膜。目前乙醇灌注是治疗IMH的主要手段之一[9]。IMH一般位置比较深，血管畸形也比较严重，不但危及患者身体健康，治疗上也有很大的风险，尤其在乙醇注射的剂量较难把握，剂量小时效果不明显，剂量过大对周围正常组织损伤严重，导致器官功能障碍，极易出现严重并发症。临床有必要探索出既能治愈血管瘤，又不增加并发症的乙醇治疗浓度。
本实验将不同浓度乙醇注入大鼠肌肉组织来观察肌肉体积变化和肌肉收缩力改变；同时组织切片观察肌肉组织学改变情况。结果发现乙醇浓度在50%～80%时，随着注射乙醇浓度增加，大鼠骨骼肌体积缩小和肌力减弱的程度均呈正增加，在光镜下肌肉组织破坏逐渐加重(见图Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ)；当乙醇浓度超过80%时，大鼠骨骼肌体积缩小和肌力减弱的程度不明显(P>0.05)，光镜下见肌肉组织基本纤维化(见图Ⅴ、Ⅵ)。说明乙醇浓度<80%时，随乙醇浓度增加对肌肉组织破坏程度加重；当乙醇浓度>80%时，肌肉组织基本完全被纤维化。毛雅君 许光旭等[11]研究报告也与实验的结果类同。
通过本实验得知，当注射乙醇浓度达到80%时，大鼠腓肠肌组织纤维化已达到最大值，再增加乙醇的浓度，只会增加对周围正常组织的损伤，而腓肠肌纤维化程度不在改变。通过乙醇与肌肉关系的这一联系，为临床利用无水乙醇治疗IMH提供一个参考。
注射低浓度乙醇可使肌肉保有一定的功能，在一定的程度上还使肌肉体积变小，后期肌肉体积不易恢复等特点，可为临床上治疗良性咬肌肥厚常存在作用不持久等缺点[12]提供一定参考。
本实验初步观察了不同浓度乙醇对大鼠骨骼肌功能一定的影响。如果要进行更为全面的观察，尚须进一步研究骨骼肌的形态、超微结构，生化指标的变化，同时还需更加深入的进行研究。
[参考文献]
[1]樊雪强,刘 鹏.肌肉内血管瘤的诊断与治疗[J].中日友好医院学报,2005,19 (4):242-244.
[2]Veriasova NN,Polysalov VN,Tarazov PG.Long-term results of local ethanol injection therapy in the treatment of hemangiomatosis of the liver[J] ......
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