增强型绿色荧光蛋白基因转染小鼠骨髓间充质干细胞的研究(2)
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参见附件(2052KB，4页)。
1.2.4 EGFP转染MSCs：取第2代MSCs，以1×106细胞密度接种于6孔板中，分别加入感染复数(MOI)为50、150、300的Ad-EGFP在完全培养基中孵育48h，其后更换新鲜的完全培养基继续培养，在荧光显微镜下观察转染细胞的生长及荧光表达情况，待荧光稳定表达后，以流式细胞仪检测转染率。
1.2.5 转染后细胞增殖能力检测：取最佳感染复数Ad-EGFP转染的MSCs，以1×107/ml浓度接种于96孔板中，每孔100μl，同时取第2代MSCs，以相同浓度及体积接种于96孔板中，每天相同时间每组各取5孔细胞，加入10μl CCK-8孵育4h，用酶标仪检测490nm吸光度值(OD值)，连续7天绘制细胞生长曲线。
1.2.6 统计学处理：数据以均数±标准差表示，用SPSS13.0统计软件处理，采用配对t检验。
2结果
2.1 MSCs的分离和培养：在倒置显微镜下观察，接种24h后细胞开始贴壁，多为小圆形及多角形，培养至第7天多数细胞伸展呈梭形并呈集落式生长，在11天左右可融合达瓶底80%～90%。传代培养至第2代时细胞形态趋于统一，呈现为长梭形细胞束装排列(图1)。
2.2 MSCs的细胞表型鉴定：用流式细胞仪检测第2代MSCs细胞表型，MSCs高表达CD105(69.01%)、CD44(95.65%)，低表达CD34(0.76%)、CD45(23.37%)(图2)。
2.3 MSCs的转化实验结果：成骨诱导3周后以Von Kossa染色，可见染色阳性的骨结节；成脂诱导后2周可见油红O染色的红色脂肪细胞(图3)。
2.4 EGFP转染MSCs：转染后10h可见有绿色荧光表达，随时间推移逐渐增强，第7天后表达率达最高并趋于稳定，体外培养28天仍可见荧光。转染率随感染复数的增加而增加，但MOI为300时镜下观察，细胞形态变化较明显，表现为细胞变形、漂浮，提示细胞受损。MOI为150时，转染率较高，且细胞形态变化不大。经流式细胞仪检测三组转染率分别为65.7%、92.3%、94.6%(图4)。
2.5 转染细胞增殖能力检测结果：MOI为150转染的MSCs与未转染的MSCs的OD值差异无统计学意义(P﹥0.05)。两组生长曲线见图5。
3讨论
3.1 BMSCs是骨髓中的非造血干细胞，它来源于中胚层，由于具有横向或跨胚层向多种组织细胞分化的能力，同时易于分离获取、体外扩增，并具备低免疫原性、易于外源基因转染和表达等优点，近年来已成为组织工程、基因治疗及细胞移植等领域中的研究热点。又由于现在我国美容医学的快速发展，使得拥有上述优势的MSCs在美容整形方面有了巨大的运用前景。由于小鼠和人类基因的同源性高，因此对mMSCs的研究是人体研究的基础。
3.2 目前，対BMSCs的分离方法主要有4种：全骨髓细胞贴壁分离法、密度梯度离心分离法、免疫磁珠分选法和流式细胞仪分选法[4]，后两种方法虽可获得较高纯度MSCs，但对实验条件要求较高，在分离过程中対细胞活性影响较大[5]；而密度梯度离心分离法虽简单易行，所得MSCs纯度较高，但对骨髓需要量较大，对于小鼠而言，工作量明显加大，不易获取足够量的MSCs。有文献报道将几种分离方法配合使用[6-8]，因存在费时、耗力、增加实验的成本、时间和实验难度，故未予采用。本实验单纯采用贴壁分离法，起初分离的细胞中包括红细胞、白细胞、MSCs、巨噬细胞和单核细胞，它们的贴壁能力各不相同，由于红细胞、白细胞为悬浮生长，多次换液后基本可清除，而MSCs、巨噬细胞和单核细胞虽然均为贴壁生长，但三者在培养板上的粘附性不同，采用胰酶消化传代时，粘附性较弱的MSCs易被洗脱，而后两种细胞粘附性强，不易被洗脱，因此随旧培养瓶被弃去。因此通过换液和消化传代的方式去除杂细胞，可获得较纯的MSCs，培养时使用10%Hyclone顶级胎牛血清完全培养基，保证了细胞的良好生长。本实验方法不仅操作简单、对实验条件要求低，所获MSCs也达到实验要求，可用于mMSCs的分离和培养。
3.3 由于MSCs缺乏特异性标记，因此鉴定主要是从形态、细胞表型及多向分化能力三个方面着手，本实验中培养细胞由小圆形逐渐长成形态均一、排列有序的梭形细胞；低表达CD34、CD45，高表达CD105、CD44以及有成骨、成脂转化能力，与文献报导一致[2,9]，表明所获细胞是骨髓间充质干细胞。
3.4 细胞移植的研究中，体内外示踪是一个重要环节。目前常用的示踪剂有GFP、Brdu、DAPI等[10-11]，其中GFP由于对细胞无毒、不影响细胞的生长和功能、产生荧光不需添加底物、生色基团的形成无种属特异性等优势，已被广泛应用作原核细胞和真核细胞的标记蛋白。而EGFP是在GFP基因的基础上，替换了影响荧光表达效率的碱基后翻译的产物，因此其荧光强度较GFP显著提高，可高达35倍[12]，更易于荧光显微镜和流式细胞仪分析。本实验采用EGFP标记MSCs，转染后10h即可见荧光表达，第7天表达至最高峰，并可稳定表达28天。而且荧光强度高，无论是在荧光显微镜下观察，还是使用流式细胞仪分析，均能获得理想效果，证实EGFP可用于mMSCs的体内外示踪。
3.5 目前常用的绿色荧光蛋白标记干细胞的方式有3种：质粒载体转染、病毒载体转染和绿色荧光蛋白转基因动物。质粒载体转染由于稳定性较差、转染率低等不足，使用受到限制。绿色荧光蛋白转基因动物由于实验周期长、成本过高，也不易推广。而腺病毒转染效率高、表达稳定、其DNA不整合到宿主基因组、转染后不改变MSC的表型及多向分化潜能[13]，应用较广泛[14-16]，本实验中使用Ad-EGFP转染mMSCs, 效果好、操作简便，在MOI为150时转染效率达92.3%，且转染后细胞病理提示受损细胞少，细胞增殖能力未受影响，与其他两种标记方式相比，试验周期短、操作简便、成本较低，表明是安全、可靠、高效的方法。为进一步研究MSCs在体内的组织修复等研究提供了实验基础。
[参考文献] ......
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