特异引物PCR快速检测可疑牙周致病菌的相关性研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(1360KB，3页)。
1.5 Pg 反应体系：终浓度 1.4 unitsTaq polymerase，280μM dNTP，1.7mM MgCL2，400nM上游引物和下游引物，11.2mM Tris-HCL;56mM KCL。
1.6 Pi Aa反应体系：终浓度 1.4 unitsTaq polymerase，280μM dNTP，1.7mM MgCl2，400nm上游引物和下游引物，11.2 mM Tris-HCL，56mM KCL。
1.7反应条件(见表3)
1.8多重PCR体系确定(见表4)
1.9 PCR敏感实验：测试原菌液裂解后260～280nm分光光度仪测定DNA浓度约634μg/ml，DNA倍比稀释依次为1、10、102、103、104、105～109均不可见DNA扩增条带。104的稀释浓度为0.65μg/ml，PCR样本量为5μl，经计算后所的结果最低检测量为3.25ng(如图1)。
3讨论
牙周病分为活动期及静止期，交替发展，对于牙周细菌变化的早期鉴定和检测对于牙周病的预防在产生骨质破坏之前有着极其重要的意义，本文所建立的PCR方法敏感度高，所检测最低DNA量为3.25ng，检测敏感性远远优于传统细菌培养法。Slots[2]报道龈下菌斑Pg阳性率细菌培养法为34.5%，直接PCR法为63.4%。Jervce-Storm P-M[3]等对22例中重度牙周炎患者的78例龈下菌群样本Pi进行细菌学鉴定发现通过传统细菌学培养方法和PCR方法的检出率分别为33%和94%,传统方法与PCR检出率存在显著差异，可见PCR方法优于传统细菌培养学方法。PCR应用与口腔细菌检测是一种可靠、稳定，敏感性极高的方法。本实验牙周炎组龈下菌斑的Pg阳性率为86.7%，明显高于牙周健康13.3%，P<0.001，与很多研究者的结果相同。Haffajee[4]对90例牙周炎患者的2 299个位点用NDA探针检测出Pg的阳性率为91%。Soder[5]对20例重度牙周炎的198个病变位点用DNA探针了解牙周病原菌的检出率，Pg为95%，与本实验的研究结果相同，故进一步印证了Pg与牙周病的相关性。
Aa的研究较多争议性较大。本实验数据显示中重度牙周病组的Aa检出率为6.7%，正常组Aa的检出率为3.3%，无统计学差异。Mobelli[6]和Tanks[7]对中国人重度牙周炎患者及健康人的研究发现Aa的检出率分别为63%和78%，健康者与患者无明显差别，认为Aa可能是中国人正常菌群的组成部分。根据Moore WEC HL[8]的报道，在牙周病患者的Aa检出率为6%，是正常人1.4%的6倍，Asikainen S等亦得到相同的结果[9]，Aa对于牙周病的相关性应进一步进行讨论和验证。
牙周病组Pi检出率为70%，正常组检出率为20%，P<0.001，中间普氏菌被认为是牙周可疑致病菌与牙周健康存在密切关系。 贾晓真[10]等采用厌氧培养和鉴定技术在受检的33例牙周炎患者中，18例患者检出了中间普氏菌,总检出率为54.54%。并且报道中间普氏菌与牙周炎中度相关，与本实验的结果相符。
PCR方法是特异性强，敏感性高的有效方法。Pg是成人牙周炎可疑致病菌，Pi是成人牙周炎可疑致病菌，Aa可能是牙周正常菌群一部分，需要大样本进一步检测。
[参考文献]
[1]Zambon JJ,HaraszthyⅥ.The laboratory diagnosis of periodontal infections[J].Periodontology,2000,7:69-82.
[2]Slots J,Ashimoto A,Flynn MJ,et al.Detection of putative periodontal pathogens in subgingival specimens by 16 Sribosomal DNA amplification with the polymerase chain reaction[J].Clin Infect Dis,1995,20(Suppl2):S304.
[3]Jervce-Storm P-M KM,Falk W,Doorfer A,et al.comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periodontopathogenic bacteria in subgingival plaque samples[J].J Clin Periodontol,2005,32:778-783.
[4]Haffajee AD,Socransky SS,Smith C,et al ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(1360KB，3页)。