自体基质血管成分改善脂肪组织移植效果的实验研究(2)
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1.3 移植方法：术前称量新西兰家兔体重并记录，按照1ml/kg耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠溶液。将家兔耳背部及背部肩胛区毛发剃除干净，固定家兔，用0.5%的碘伏消毒背部肩胛区以及耳背部，在背部肩胛区中心距离颈部5cm处，做一长度约5～8cm的切口，切开全层皮肤。切取约(15±0.5)g脂肪组织[4]。用PBS冲洗脂肪组织2次，剔除血块和结缔组织，并剪成直径约1mm3的脂肪颗粒，用生理盐水离心清洗(200g, 2min)，置于4℃冰箱备用。实验组用无菌注射器吸取10ml脂肪颗粒置于50ml无菌三角烧杯中，加入0.25%的Ⅰ型胶原酶10ml，37℃恒温振荡50min[5-6]。再将消化后的脂肪悬液离心(600g,10min)。倒掉上层液体，用生理盐水重悬浮，再次离心(600g,10min)。然后吸出上层液体，剩余约0.2ml沉淀物即为基质血管成分(SVF)。用骨膜分离器将家兔耳背部皮肤和软骨之间分离直径为3cm的圆形腔隙。用注射器吸取2ml清洗后的脂肪颗粒与0.2ml生理盐水(NS)，混合后采用18#注射针头注入左耳移植区，作为对照组；吸取清洗后的脂肪颗粒2ml与0.2mlSVF混合后，采用相同的方法注入家兔右耳移植区域，作为实验组[7]。
1.4检测指标及方法
1.4.1 B超体积测量及游标卡尺体积测量：于术后当日、1月、3月和6月分别用B超和游标卡尺测量移植脂肪组织的纵径、横径和厚度，采用体积计算公式：V=a×b×c×0.5(a为纵径，b为横径、c为厚度),分析移植脂肪组织的吸收变化情况[8]，脂肪组织存活率和吸收率分别采用下列公式计算：存活率(%)=术后时间点移植脂肪组织体积/移植当日脂肪组织体积，吸收率(%)=1-成活率[9]。
1.4.2 大体观察：术后观察移植区域的反应，有无感染、坏死等现象。取材后观察移植物的外观、体积、有无坏死等。
1.4.3 HE染色：在术后6个月将家兔实施安乐死，将移植的脂肪组织用4%的中性多聚甲醛固定，石蜡切片，进行常规HE染色，显微镜观察组织结构及照相。
1.5统计学处理：采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。资料采用配对t检验比较两组之间的差别，P<0.05，差异有统计学意义。
2结果
2.1 自体SVF对脂肪颗粒移植的作用：自体脂肪组织移植实验12例，手术均成功，术区未见血肿及感染。脂肪组织内部未见明显的坏死变性区域。实验组与对照组在体积方面存在明显的差异(见图1)。
术后1、3、6个月，对照组(AG+NS)和实验组(AG+SVF)随着时间的延长，脂肪组织体积均有所吸收(见表1)。对照组术后1、3、6月脂肪组织存活率分别为：(64.35±8.36)%、(58.22±2.88)%、(50.61±9.47)%；实验组术后1、3、6个月脂肪组织存活率分别为：(77.42±5.1)%、(67.95±6.09)%、(72.75±4.37)%。对照组脂肪组织随着时间的延长而逐渐出现明显的吸收；实验组吸收缓慢，术后6个月脂肪组织的体积比术后3个月的体积有所增长(见图2)。术后6个月实验组、对照组移植脂肪组织的吸收率分别为(27.25±4.37)%和(49.39±9.47)%，比较有显著性意义(P<0.05)。(见表1)
2.2移植脂肪组织HE染色观察：术后6个月，移植脂肪组织HE染色结果显示所有标本脂肪细胞呈圆形或多边形，细胞中央有一大脂滴，胞质呈薄层，位于细胞周缘，包绕脂滴。未见炎症、坏死等表现。实验组与对照组在组织学方面未见明显差异(见图3)。
3讨论
先天性畸形、外伤、肿瘤切除等常常造成口腔颌面部软组织缺损。目前软组织缺损修复的方法很多，如自体组织瓣修复、人工合成材料修复、自体脂肪组织移植[10]等等。然而，各种方法都存在不同的缺点，如供区损伤、排异反应、组织吸收等。其中自体脂肪组织抽吸注射移植是最常用的方法之一。它具有来源丰富、获取方便、无排异反应、供区损伤小等特点。然而，自体脂肪组织抽吸注射移植的效果存在不可预知的吸收率(20%～90%)[1-2]，往往需要过度充填或重复注射2～3次，才能达到满意的效果。因此，许多学者在这一领域展开大量的研究[1-2,4,11-14]，试图找到解决这一难题的方法。
基质血管成分(SVF)主要包含成熟的脂肪细胞、脂肪前体细胞、脂肪来源的干细胞、成纤维细胞、各种血细胞等。研究表明，脂肪来源的SVF能够向成骨、成软骨、成脂肪、成血管、和神经等方向分化[15]。Daisuke Matsumoto等从绿色荧光蛋白大鼠腹股沟脂肪组织中提取SVF，与普通SD大鼠的脂肪组织相混合，然后移植到普通SD大鼠体内，来追踪ADSCs的发展变化。结果表明，脂肪干细胞分化成了血管内皮细胞，并有助于脂肪移植过程中血管化的形成[16]。
本实验制备自体脂肪来源的SVF与自体脂肪颗粒复合移植。结果表明，SVF能够明显改善移植脂肪组织成活的微环境。移植术后1～6个月连续观察，实验组移植脂肪成活率明显提高(图2)，吸收率明显下降(表1)。实验组术后6个月脂肪组织体积较术后3个月有所增长，可能与SVF中脂肪来源干细胞向成熟的脂肪细胞方向分化有关。本课题组认为SVF中含有的脂肪来源的干细胞(ADSCs)在其中发挥重要的作用。一方面脂肪干细胞能够向血管内皮细胞转化，促进血管的形成，有利于移植脂肪组织的成活；另一方面脂肪干细胞在体内向成熟的脂肪细胞转化，从而增加了移植脂肪组织的体积。
根据我们前期的实验和有关参考文献[7]，我们发现基质血管成分的含量与术后脂肪组织移植的体积的增长成正相关，如果加入基质血管成分过多，会使得术后脂肪组织的体积过度增长；加入基质血管成分太少，移植脂肪组织的体积达不到预期效果。我们采用从5份脂肪组织中获取的基质血管成分加入到1份脂肪颗粒中，能够取得较为理想的脂肪移植效果，使得移植6个月后脂肪组织的吸收率仅为(27.25±4.37)%，远低于单纯脂肪移植。
此外，从自体脂肪组织中提取SVF，不需要体外培养，直接应用于自体移植，具有成活率高、吸收率低、使用安全、制备简便和价格低廉的优点 ......
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