肝细胞生长因子对大鼠背部超长任意皮瓣存活率影响的实验研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(3349KB，4页)。
1材料和方法
1.1 实验试剂及器械：健康标准成年S-D大鼠，体重300～350g、雌雄不限(广西医科大动物实验中心提供)。肝细胞生长因子(美国PeproTech公司),鼠抗人单克隆CD+34抗体MAB-0034(福州迈新生物技术开发技术有限公司)，快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物(福州迈新生物技术开发技术有限公司)，DAB显色试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)。显微镜及病理图像分析仪DMR+Q550(德国LEICA公司)，实验在广西医科大学动物实验中心及一附院完成。
1.2 实验方法
1.2.1HGF溶液的稀释配制：启用前离心，用Hanks液配制成2 000ng/ml的原液后分装于10个分装瓶中。加10%FBS溶液及Hanks液配制成50ng/ml贴上标签，在-20℃冰箱保存备用。
1.2.2动物模型制备及实验分组：健康标准成年S-D大鼠20只，体重300～350g，随机分成A、B两组，每组10只，A组：HGF；B组：生理盐水组。10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔注射麻醉，将动物俯卧位固定，背部用硫化钠脱毛后温水洗净。于大鼠背正中掀起8.0cm×2.0cm任意皮瓣，其纵轴与大鼠脊柱平行，且以之为对称轴，蒂位于双侧髂嵴连线上。在距离蒂部3.6cm、4.8cm、6.0cm处分别作为蒂部平行的直线，与顺皮瓣长轴的三等分线相交于六点，这六点为注射位点[3]。切开皮肤及皮下，于筋膜浅层掀起皮瓣，结扎基底部活跃出血点。皮瓣掀起后即刻以1ml微量注射器于皮下进针，A组皮瓣下每一注射位点给予50ng/ml HGF溶液0.5ml，B组皮瓣下每一注射位点给予生理盐水0.5ml。4-0丝线将皮瓣原位间断缝合。术后切口涂四环素软膏，单笼喂养。所有手术均由同一人完成。
1.3 检测指标
1.3.1术后大体观察：观察动物术后的饮食、活动及创面愈合情况。
1.3.2皮瓣大体观察，存活率的检测：术后7天处死大鼠，皮瓣存活区与坏死区已明确。皮瓣坏死标准：皮肤颜色变黑、组织回缩、弹性差、质地变硬、切割组织不出血。用透明纸绘出皮瓣形状及坏死皮瓣大小，将坏死区域涂成黑色，数码相机拍照并输入计算机，使用病理图像分析仪DMR+Q550计算出坏死面积。存活面积=设计面积一坏死面积，按(存活面积/坏死面积)×100%计算出存活面积比。
1.3.3组织学观察：术后7天，切取皮肤标本(在存活区，距存活与坏死交界处0.5cm)，10%甲醛固定，常规石蜡包埋，HE染色，光镜200倍下观察其组织学变化、毛细血管管腔情况。
1.3.4 免疫组织化学染色进行微血管分析：10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片；融蜡后用纯二甲苯中浸泡；不同浓度酒精梯度水化后冲洗；3% H2O2甲醇溶液封闭内源性过氧物酶的活性后冲洗；柠檬酸组织抗原修复液工作液高压抗原修复；滴加鼠抗人单克隆CD+34抗体MAB-0034后4℃恒温箱过夜；37℃复温后冲洗；滴加即用型IgG抗体-HRP多聚体，室温下孵育后冲洗；滴加新鲜配置的DBA显色剂，控制染色后自来水冲洗，终止显色反应；苏木素轻度复染后1%盐酸酒精水化，自来水冲洗；PBS冲洗返蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。所有切片均按照试剂盒的要求在相同条件下染色。镜下随机选取4个视野，以单个血管内皮细胞或成簇的血管内皮细胞作为一个毛细血管，单个高倍镜视野下微血管的数目，取其平均值。测出每个高倍镜视野面积，并计算单位面积下微血管数目(个/mm2)，作为评价微血管密度的指标。
1.4 统计学处理：数据均用(x±s)表示，采用SPSS16.0统计软件进行分析。两组间比较采用完全随机两样本均数比较t检验，两组数据经正态检验。
2结果
2.1术后大体观察：大鼠到实验结束均存活，饮食、排便正常，没有术后感染、化脓、体液渗出等不良反应。
2.2皮瓣大体观察：存活率的检测 A、B两组皮瓣远端均出现不同程度的皮肤颜色变黑、质地变硬、切割组织不出血，出现明显的坏死迹象。A组皮瓣成活区域皮肤的颜色、弹性及质地与正常皮肤组织更相似，坏死区域面积比B组少。A、B两组皮瓣成活面积分别为(81.45%±2.74%)、(42.82%±7.03%)，两组间皮瓣存活率差异有统计学意义(t=16.192，P=0.000)。
2.3组织学观察：术后7天，A、B两组大鼠皮瓣均有毛细血管腔出现，真皮层内有大量的血管内皮细胞。A组管腔数量明显多于B组，且管腔的结构好，管腔壁变薄富有弹性，管腔内可见红细胞。B组虽然有大量内皮细胞存活，但呈现无序排列，红细胞沉积较少(如图1～3)。
2.4免疫组织化学染色分析：术前及术后7天两组大鼠背部皮瓣CD+34免疫组织化学染色计算毛细血管的平均密度：A组分别为12.70±1.35、39.67±4.83；B组分别为12.31±1.22，21.50±1.87。实验前A组、B组差异无统计学意义(t=0.667，P=0.513)，实验后A组、B组差异有统计学意义(t=11.100，P=0.000)，A组实验后与实验前差异有统计学意(t=16.253,t=0.000)，B组实验后与实验前差异有统计学意义(t=13.992，t=0.000)。(如图4～6)。
3讨论
3.1 HGF是Michal Lopoulos等[4-5]在部分肝被切除后的大鼠血浆中发现能够刺激肝细胞DNA合成的多肽因子，后经提取纯化并命名的一种具有多功能的间质源性细胞因子。它是由分子量75kD的重链(亦称α链)和分子量30kD的轻链(亦称β链)通过二硫键构成的二聚体。其主要来源于肝脏枯否氏细胞、内皮细胞、成纤维细胞、贮脂细胞、肺脏内皮细胞以及恶性肿瘤细胞。
3.2 任意皮瓣移植后，其血运主要靠蒂部的不知名的血管、真皮下血管网、筋膜血管网等周围血管束的侧支供血，同时皮瓣远端的毛细血管的快速形成对预防及治疗远端缺血也起重要的作用[6]。新生血管的形成是一个非常复杂的过程，首先血管扩张及通透性增加，后经过血管基底膜酶解，血管内皮细胞活化、增殖、迁移、血管腔形成，周边细胞及平滑肌细胞的作用等多个步骤协调有序地完成，最后形成新生血管网。国内外在心脏缺血性动物模型的研究[7-8]均表明HGF能够促进缺血性心肌的微小血管再生，增加内皮细胞的数量及心肌的血流量 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(3349KB，4页)。