他克莫司预防兔耳瘢痕增生的实验研究(2)
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1.3.2 术后第14、21、28、35及49天取材，随机处死2只兔子，沿创面边缘扩大0.5cm环行切取瘢痕组织。每个标本沿垂直于瘢痕最凸起点处纵行切开，分为两半，其中一半即刻以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，行苏木素-伊红(HE)染色，在400倍光镜下观察HE 染色切片，每张切片于真皮层随机选取5个视野，统计单位面积内成纤维细胞的密度；另一半提取mRNA行PCR检测。
1.3.2.1 Masson三色染色，在40倍光镜下观察Masson三色染色切片。
1.3.2.2 Real-time PCR检测细胞外基质成分ColI和Fn，Th2产生的重要纤维化基因IL-4及参与T细胞早期活化的重要基因M-CSF和TNF-α的表达。引物由上海生工合成，设计如表1所示，Tm值设定为60℃。将各时间点瘢痕标本，提取RNA，反转录为cDNA，进行Real-time PCR的检测。采用SYBR GreenⅡ染料在MJ Research Option 2荧光定量PCR仪上检测目的基因的表达。Real-time PCR反应体系20μL。PCR反应条件：激活95℃，10min；40循环，变性95 ℃，30 s；退火55℃，30 s，延伸72℃，60 s。扩增完毕后，进行熔解曲线分析，95℃，1 min，50℃，1 min，以0.10℃/s的速度升温到95 ℃，连续监测荧光。扩增结束后分析熔解曲线，在熔解曲线上以具有单峰判断PCR扩增的单一性。同时设无模板对照，每份标本行2次Real-time PCR检测，取平均值。对cDNA模板进行倍比稀释，以2X,1X,0.5X,0.25X四个浓度梯度的cDNA模板进行Real-time PCR扩增。将不同浓度模板的对数和相应到达阈值的循环数(Ct)值作图，做标准曲线。基因mRNA表达采用直线相关回归分析，GAPDH的表达量作为内参照，分析目的基因的相对表达量。
1.3.3 实验结果均以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS11.5软件进行t检验处理数据，P<0.05为差异有统计学意义。
2实验结果
2.1 成功复制兔耳增生性瘢痕模型：上皮化的时间为(14±1.25)天，无创面感染、分泌物增多等现象，实验动物饮食生活正常。伤后(21±1.96)天，可见他克莫司软膏组实验组较凡士林软膏空白对照组瘢痕增生程度明显减轻，空白组瘢痕明显突出，色红，质硬，创面中心处为增生最严重处，伤后(28±1.83)天达到高峰。
2.2 HE染色：可见伤后第28天、35天及49天实验组较空白组成纤维细胞密度明显减少(如表2、图1)。
2.3 Masson三色染色：Masson三色染色则可见空白组胶原纤维结构较实验组致密，粗大，且异常沉积，颜色呈深蓝色(如图2)。
2.4 Real-time PCR检测：Real-time PCR分析可见他克莫司对细胞外基质成分ColI和Fn，Th2产生的重要纤维化基因IL-4及参与T细胞早期活化的最要基因M-CSF和TNF-α的表达均有明显抑制作用，两组中空白组ColI的表达在伤后21天达到高峰，Fn的表达在伤后第28天达到高峰，IL-4、M-CSF和TNF-α表达均在伤后第35天达到高峰，但实验组表达明显较低，其差异P<0.01有统计学意义(如图3)
3讨论
3.1 在创面愈合过程中，早期大量单核细胞浸润，包括巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞、淋巴细胞及浆细胞聚集，形成增生性瘢痕的分子机制十分复杂。这些细胞在形成增生性瘢痕过程中发挥的作用并不十分明确，但无疑免疫细胞在其中发挥了十分重要的作用。免疫细胞以T淋巴细胞为主，其中创伤愈合早期淋巴细胞以CD4+Th2细胞为主[6]，在抗原刺激下，分泌细胞因子激活巨噬细胞，同时巨噬细胞分泌细胞因子可作用于淋巴细胞，刺激其分泌。其中IL-4、IL-5及IL-13等因子分泌大量增加，TGF-β分泌亦显著增加，由CD4+ Th1细胞分泌为主的IL-12和IFN-γ表达量则很低。CD4+Th2及其分泌的IL-4、IL-5和IL-13与纤维增生过程则有着紧密联系[7]。晚期CD4+ Th2细胞逐渐减少，CD4+ Th1细胞逐渐增加，CD4+ Th2和CD4+ Th1在胶原合成中作用相反[8]。也有学者研究发现局部应用环孢菌素A治疗瘢痕疙瘩时，瘢痕组织中T淋巴细胞明显减少，并显著抑制了成纤维细胞的活性，从而抑制了瘢痕疙瘩的生长[9]。
3.2 已有研究发现，他克莫司软膏作为临床上常用的免疫抑制剂应用于创面早期，可有效预防兔耳瘢痕增生[10]。但是其机制尚不明确，为进一步了解增生性瘢痕形成的机制，我们选择他克莫司软膏进行伤后创面早期干预。他克莫司为免疫抑制性大环内酯类药物，在皮肤科应用广泛，已被证实可以抑制T淋巴细胞活化，临床上可以用来治疗激素效果不佳的特应性皮炎。亦有文献报道，他克莫司软膏用于瘢痕疙瘩治疗，可以显著减轻其症状[11]。
3.3 本实验通过形态学观察，成纤维细胞密度统计及Real-time PCR检测结果发现，实验组瘢痕增生明显减轻，证实了伤后早期给予免疫抑制剂，可以有效预防瘢痕增生。但是其何时开始用药，仍未十分明确。过早使用可抑制创面愈合，过晚使用则无法有效阻止CD4+ Th2过度聚集。我们推测，如应用于人体，可在缝合拆线后开始使用，在瘢痕好发部位使用效果更佳。同时，用药疗程也值得进一步研究。本实验提出早期创面使用免疫抑制剂可以抑制瘢痕增生，并给予证实，有助于瘢痕增生机制的阐明，是增生性瘢痕预防及治疗的一种全新思路，具有非常良好的应用前景，很值得做更广泛和更深入的研究。
[参考文献]
[1]Shockman S,Paghdal KV,Cohen G. Medical and surgical management of keloids:a review[J]. J Drugs Dermatol,2010,9(10):1249-1257.
[2]Castagnoli C,Trombotto C,Ondei S,et al. Characterization of T-cell subsets infiltrating post-burn hypertrophic scar tissues[J]. Burns,1997, 23(7-8):565-572.
[3]Nunzi E,Parodi A,Rebora A.Immunofluorescence findings in haematoporphyrin-induced keloid[J]. Br J Dermatol,1983,108(3):263-266.
[4]Morris DE ,Wu I ,Zhao LL ,et al. Acute and chronic animal models for excessive dermal scarring: quantitative studies[J] ......
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