低强度脉冲超声刺激对人类牙周膜细胞BMP-2表达效应的研究(2)
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1材料和方法
1.1 主要材料与设备：改良型α-MEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；BMP-2引物(大连TaKaRa公司合成)； RNAiso Plus裂解液(大连TaKaRa公司)；SYBR Premix Ex Taq TMⅡ(大连TaKaRa公司)；dNTP Mixture(大连TaKaRa公司)；Random Primer 6mer(大连TaKaRa公司)；Ribonuclease Inhibitor(大连TaKaRa公司)；M-MLV Reverse Transcriptase(美国Promega公司)； DEPC(美国Bio Basic Inc公司)；六通道LIPUS换能器由重庆医科大学超声医学工程中心提供；荧光定量PCR仪Rotor-Gene 6000实时定量核酸扩增系统(澳大利亚Corbett Life Science公司)。
1.2 h-PDLCs体外培养：人类牙周膜标本来自重庆医科大学附属口腔医院颌面外科门诊，在征得患者及家长同意下收集12～20岁健康青少年因正畸需要拔除的双尖牙。无菌条件下，用含双抗(青霉素、链霉素)浓度为100单位/ml的PBS液反复冲洗洗牙齿去污和灭菌，直至牙齿和冲洗过的PBS液不再有血污。此时将洗净的牙齿移人另一无菌培养皿中，滴加少许含20%胎牛血清的DMEM培养液，保持根面湿润。用无菌刀片反复纵横切割根中l/3的牙周膜组织，仔细进行刮除，使组织块小于1mm×1mm×1mm。将刮下的组织碎屑用含双抗的PBS液漂洗2次，吸除多余水分。用无菌口腔探针小心将组织块以均匀间距接种于六孔板底壁上，滴加少量含20%胎牛血清α-MEM培养基，置CO2培养箱(5% CO2、95%空气、l00%湿度，37℃恒温)孵育，隔夜后再加将培养基补至约1.5ml。待原代细胞长满单层后进行传代， 0.125%胰蛋白酶进行消化，约3～5min后细胞间隙增大，胞体回缩变圆。此时加入含10%胎牛血清的α-MEM终止消化，轻轻拍打瓶壁使细胞从瓶壁上脱落下来，并用吸管吹打均匀形成细胞悬液，转移细胞悬液入离心管，1 000rpm×5min离心后弃去上清液，加入适量培养基充分吹打，按1:2比例传代接种于细胞培养瓶中。
1.3 LIPUS处理及RNA提取：取第4代H-PDLCs接种于六孔细胞培养板，对应六通道LIPUS发射仪，采用通过超声耦合剂作为媒介的辐照方式。设定LIPUS参数频率：1.0～1.5 MHz；脉冲重复频率：1.0kHz；脉冲占空比：1:5；幅宽：200μs；输出强度90mW/cm2；辐照时间：20min/天。连续处理1周，分别于处理第1、3、5、7天后提取细胞RNA。
使用RNAiso裂解液提取总RNA。弃去细胞培养基，用PBS漂洗2遍。每孔中加入1ml的RNAiso裂解液，轻轻摇晃使其与细胞其充分接触，然后静置5min。移液枪充分吹打使细胞脱落，转移至1.5mlEP管中。向裂解液中加入200μl氯仿，盖紧EP管盖，用力震荡，使溶液充分乳化，静置5min。12 000g，4℃离心15min。此时液体分为三层，无色透明上清层为RNA，白色中间层为蛋白质，粉红下层色为无机层。小心吸取上清层，移至新的1.5mlEP管中。(注意勿吸出白色中间层)向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒EP管充分混匀，静置10min。12 000g，4℃离心10min。弃上清，管底见少量白色沉淀物质，即为RNA。无水乙醇和DEPC水现配成75%的乙醇1 000μl，洗涤RNA沉淀。12 000g， 4℃离心5min。小心弃去乙醇，保留沉淀，在空气中气干3～5min。加入DEPC水溶解RNA。
1.4 实时定量PCR检测：取2μg总RNA，加入0.5μg引物6聚体，加DEPC水补足体积15μl。混匀后上RT-PCR仪进行逆转录，设置程序为70℃，5min。第一步完成后取出EP管立即冰浴，稍离心。加入试剂M-MLV 5×buffer 5μl，dNTP 2.5μl，M-MLV RT 1μl，Ribonuclease Inhibitor0.625μl，DEPC水补足至总体积25μl。程序设置为37℃，60min→4℃延伸。
c-DNA制备完成后，进行实时定量PCR检测。加入反应体系SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5μl，cDNA1.0μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，ddH2O 10.5μl。程序设定：95℃预变性30s；95℃，10s；退火温度54℃，30s；72℃，30s； 45个循环。PCR引物合成序列见表1。实时定量PCR扩增曲线见图1，实时定量PCR溶解曲线见图2。
1.5 统计分析：采用SPSS 13.0统计软件对△Ct值组间差别比较进行方差分析。采用2^(-△△CT)法对BMP-2扩增结果ct值进行相对定量分析。
2结果
2.1 LIPUS处理对H-PDLCs内BMP-2基因表达的影响：实时定量PCR结果显示，LIPUS处理后H-PDLCs第1天、3天、5天、7天BMP-2表达均有不同程度增高。以同期培养的未受LIPUS处理的H-PDLCs为对照，其中处理第1天，△Ct值处理前后组间无差异(P>0.05)；处理第3天BMP-2表达增加6.07倍，△Ct值处理前后组间差别具有统计学差异(P<0.05)；处理第5天BMP-2表达增加2.3倍，△Ct组处理前后间差别具有统计学差异(P<0.05)；处理第7天，△Ct值处理前后组间无差异(P>0.05)。
2.2 人类牙周膜细胞受LIPUS刺激后BMP-2基因表达的时间变化趋势：LIPUS对H-PDLCs处理后的第1天BMP-2增加不明显，处理后第3天，BMP-2表达明显升高，相对空白组增加6.07倍，而后开始下降，在处理后第5天BMP-2相对表达下降至2.30倍，在第7天回到初始水平。BMP-2表达水平见图3。
3讨论
LIPUS指强度在100 mW/cm2 以下的脉冲式超声波，在两个脉冲之间有较长的间歇时间，相对产热较弱，不具侵入性[4]。以往大量研究证实LIPUS可有效促进新鲜骨折愈合、治疗骨不连等[9-10] ......
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