血肿中的铁对任意皮瓣毒性作用的研究(2)
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1.2 实验方法
1.2.1 实验分组：8头白色小型猪，在每头猪脊柱两侧设计12个术区，形成4cm×6cm大小的任意皮瓣。8头猪共96个皮瓣。遵循随机化原则，把皮瓣分为四个组，分别为对照组、生理盐水组、血肿组、去铁胺组，每组24个皮瓣。对照组：皮瓣形成后无其他处理；生理盐水组：皮瓣形成后向皮瓣下注入15ml生理盐水；血肿组：在皮瓣形成后向皮瓣下注入15ml自体血液；去铁胺组：在皮瓣形成后向皮瓣下注入15ml自体血液和270mg甲磺酸去铁胺。
1.2.2 动物模型的制备
1.2.2.1手术设计：应用氯胺酮(首次麻醉剂量12mg/kg, 全麻维持量为6mg/kg/30min)、速眠新(首次麻醉剂量0.08ml/kg, 全麻维持量为0.04ml/kg/30min)进行麻醉。在猪一侧的耳缘静脉上建立静脉通路，给予0.9%NaCl缓慢维持滴注，维持循环血量，并在术中间断给予青霉素、东蓑若碱等药物。术区均用0.5%碘伏消毒2遍。在小型猪的脊柱两侧分别设计6个任意皮瓣，大小为4cm×6cm。
1.2.2.2 手术操作：用0.5%利多卡因局部浸润麻醉，依照设计切开皮肤，形成4cm×6cm 的任意皮瓣，蒂在脊柱侧。皮瓣缝合前在皮瓣下置入注液导管，以便注入血液和药物。
1.2.2.3 取血方法：待皮瓣制作完成后，开始抽取小型猪的血液。于颈部侧前方做切口，用组织剪钝性分离下方的筋膜组织和肌层，即可显露直径约8mm的颈外静脉，1号线结扎静脉的近心端后，静脉变粗，用20ml注射器刺入静脉抽血，最多可抽出静脉血70ml。还可从猪的后肢内侧浅表静脉抽血，方法如下：用备皮刀刮除局部猪毛，观察静脉走行，选择较粗且直的血管，75%酒精消毒，助手用力压住静脉近心端，术者拍打静脉，用10ml注射器穿刺血管抽血，此法能抽出静脉血25ml。
1.2.2.4 通过留置的导管向生理盐水组皮瓣下注入15ml生理盐水；向血肿组皮瓣下注入15ml血液；向去铁胺组皮瓣下注入15ml血液和270mg甲磺酸去铁胺，拔出注液导管时，预留缝线打结，防止注入的血液外溢。
1.2.3 取材：各组分别在术后24h、72h和120h于皮瓣中央切取1cm×1.5cm大小的全层皮瓣，每组每个时间点取8个皮瓣。所取组织保存于-70℃冰箱中。
1.2.4 检测指标和方法
1.2.4.1皮瓣血流灌注量检测：每组随机选8个皮瓣，于术后2h采用PIM-II型激光多普勒血流量图像仪检测皮瓣的血流情况。方法如下：小型猪侧卧位，用棉垫垫高猪的背部，使皮瓣与地面平行，取皮瓣中心为扫描中心，激光探头与皮瓣的垂直距离为15cm，扫描范围30×30像素，读取血流灌注量(电压值为V)，并取三次测量的平均值。
1.2.4.2 皮瓣中铁离子含量测定：选择标本中没有皮瓣内出血的部位，取全层皮瓣进行检测。样品置于50ml锥形瓶中，加入防爆玻璃珠5个，加入V(硝酸):V(高氯酸混合酸)(4:1)10ml，上端放一歪嘴漏斗，放置12h进行消化。电热板缓慢升温，升温到200℃～250℃，持续加热至白烟散尽，此时溶液接近无色，蒸近干，稍冷却，加约5ml去离子水，再加热，蒸除余酸，冷却。用去离子水冲洗三角瓶及歪嘴漏斗，将消化好的样品溶液转入25ml容量瓶中，定容至25ml，摇匀待测。用火焰原子吸收法测定皮瓣中铁含量。
1.2.4.4 丙二醛含量及髓过氧化物酶活性的测定：术后24h、72h和120h于皮瓣中央切取全层皮瓣组织，称重。按重量体积比为1:19加入匀浆介质，冰水浴中匀浆，制成10%组织匀浆液, 依照丙二醛(malondialdehyde, MDA)测定试剂盒(硫代巴比妥酸法)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)测定试剂盒说明书步骤，测定所取皮瓣组织MDA含量及MPO活性，皮瓣组织中蛋白含量用考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒定量。
1.2.4.9 统计学处理：数据用x±s表示，应用SPSS13.0 软件对数据进行方差分析，P<0.05示差异有显著性。
2结果
2.1 皮瓣血流灌注量检测结果：各组皮瓣形成术后2h皮瓣血流灌注量无显著差别(P﹥0.05)(见表1)。
2.2 皮瓣组织铁含量检测结果：对照组皮瓣铁含量在术后72h时较24h升高(P﹤0.01)，术后120h时较术后72h下降(P﹤0.01)。生理盐水组皮瓣中铁含量在术后24h、72h和120h时与对照组无显著性差异(P﹥0.05)。血肿组术后72h的皮瓣标本中铁含量较术后24h显著增加，到术后120h时也没有明显降低(P﹥0.05)。术后24h、72h和120h血肿组皮瓣铁含量较对照组显著升高(P﹤0.01)。去铁胺组皮瓣中铁含量在术后24h、72h和120h时均显著低于血肿组(P﹤0.01)，与对照组无显著性差异(P﹥0.05)(见表2)。
2.3 皮瓣组织MDA含量检测结果：在对照组的皮瓣中，MDA含量在术后72h时达到高峰，术后120h时较术后72h下降(P﹤0.01)；生理盐水组皮瓣中MDA含量在术后24h、72h和120h时与对照组无显著性差异(P﹥0.05)。而血肿组皮瓣的MDA含量在术后72h时达到高峰，120h时仍维持在很高的水平，与72h时的含量无显著差异(P﹥0.05)。在术后24h时，MDA含量在血肿组和对照组间无显著差异，而在术后72h和120h时血肿组的皮瓣MDA含量都显著高于对照组(P﹤0.01)。去铁胺组术后24h皮瓣的MDA含量与血肿组相比无统计学差异(P﹥0.05)，而在术后72h和120hMDA含量比血肿组显著降低(P﹤0.01)，但仍高于对照组(P﹤0.05)(见表3)。
2.4 皮瓣组织MPO活性检测结果：对照组的皮瓣中，MPO活性在术后72h时显著高于术后24h(P﹤0.01)，达到高峰，120h时有所下降(P﹤0.01)；生理盐水组皮瓣中MPO活性在术后24h、72h和120h时与对照组无显著性差异(P﹥0.05)。而血肿组MPO活性于术后72h时达到高峰，120h时仍维持在很高的水平，与72h时无显著差异(P﹥0.05)。血肿组术后24h、72h和120h的皮瓣MPO活性都显著高于对照组。去铁胺组在术后24h、72h和120h时皮瓣的MPO活性与血肿组相比无统计学差异(P﹥0.05)(见表4)。
3讨论
3.1 血肿模型的制作：制作血肿动物模型的方法有两种：①从身体其他部位取血后直接注入试验部位造成血肿[4]；②向试验部位注入胶原酶使血管破裂造成血肿[5] ......
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