人脐带间充质干细胞与蚕丝蛋白支架构建组织工程脂肪的研究(2)
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Key words: human umbilical cord mesenchymal stem cells; silk fibroin; scaffolds;adipose; tissue engineering
我们的前期工作已就蚕丝蛋白多孔支架作为人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)体外培养的天然支架的可行性，以及适宜于hUCMSCs体外培养的蚕丝蛋白多孔支架的最佳孔径进行了研究，并获得了肯定的结果[1-2]。本研究皆在通过在体外将hUC MSCs与蚕丝蛋白多孔支架进行复合培养，并在成脂诱导条件下初步构建出组织工程脂肪的基础上，进行体内移植，观察其演变过程。
1材料和方法
1.1 主要材料与仪器：Wistar大鼠，体重200±10g，雌雄不限(购自甘肃省中医学院实验动物中心)；蚕丝蛋白多孔支架(孔径50～60μm，浙江大学丝绸中心闵思佳教授惠赠)。
LG-DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(FBS，北京鼎国生物技术责任有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶、地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX)(美国Sigma公司)，荧光素四乙酸甲酯(cellstain -calcein-AM)(日本DoJINDO公司),倒置显微镜(日本Olympus公司)，扫描电镜(日本电子光学公司)，CO2孵箱(美国Shellab产品)。
1.2 hUCMSCs的体外分离、培养和鉴定：脐带取自兰州军区兰州总医院产科剖宫产健康足月儿，均经产妇本人及其家属授权同意，无菌采集后4～6h内处理。按本实验室方法进行hUCMSCs的分离、培养和鉴定[2]。
1.3 蚕丝蛋白多孔支架制备：将蚕丝蛋白多孔支架材料制备成1.5cm(长轴)×0.8cm(短轴)×0.2cm(厚度)大小椭圆形。75%酒精浸泡30min，风干、紫外线照射30min备用。
1.4 hUCMSCs与蚕丝蛋白多孔支架复合培养：将浓度为1.0×106细胞/ml第2代hUCMSCs悬液, 滴在备好的蚕丝蛋白多孔支架上，分别放入24孔培养板中，在37℃气浴恒温振荡器中振荡4h，使细胞充分均匀吸附在支架上后补足含10%FBS的LG-DMEM培养液，使hUCMSCs-支架复合物完全浸没，每3天换液1次，培养10天。
1.5 体外构建组织工程脂肪：hUCMSCs与支架复合培养第10天时，加入成脂诱导液(含10% FBS、10-6mol/ L地塞米松、0.5mmol/L IBMX、60μmol/L吲哚美辛、5mg/L胰岛素的LG-DMEM培养基)，每3～4天全量换成脂诱导液1次，复合培养4周、6周后行油红O染色，倒置显微镜下观察蚕丝蛋白多孔支架中hUCMSCs成脂情况。
1.6 体外构建的组织工程脂肪体内移植与观察：将体外经过成脂诱导6周的hUCMSCs与蚕丝蛋白多孔支架复合物(初步构建的组织工程脂肪)移植到Wistar大鼠后肢肌肉内，同时，移植同体积支架材料作为空白对照(图1)。移植后4周和8周(各10只)取出移植物，冰冻切片，行油红O染色、HE染色以及扫描电镜观察。
2结果
2.1 体外构建的组织工程脂肪中hUCMSCs的成脂情况：hUCMSCs与蚕丝蛋白多孔支架复合培养、并成脂诱导4周后，油红O染色显示，蚕丝蛋白多孔支架网眼内已可见成脂样细胞生成(图2)，6周后见大量成脂样细胞生成，并与蚕丝蛋白多孔支架牢固粘附(图3)。
2.2 体外构建的组织工程脂肪体内移植后的大体观察：移植4周后可见实验组移植物较植入前体积略小，色微黄，质稍硬，表面有透明薄膜形成，膜中分布有新生血管网；移植8周，移植物较移植4周时体积进一步缩小，色微黄，质变软，表面包裹一层薄膜，该膜内可见丰富的血管网(图4)。
2.3 体外构建的组织工程脂肪体内移植后的组织学观察：移植4周后油红O染色，可见实验组移植物支架材料中新生脂肪组织及细胞呈橙红色，HE染色显示支架网眼内有新生脂肪组织，并可见少量炎性细胞浸润及渗出性浆液(图5)；移植8周，油红O染色见支架材料中着橙红色组织较前明显增多，部分呈片状融合，HE染色显示新生脂肪明显增多，仍有少量炎性细胞浸润(图6)。
2.4 体外构建的组织工程脂肪体内移植后的扫描电镜观察：移植4周时扫描电镜可见支架材料网眼内有球形、表面光滑的脂肪细胞(图7)，8周后支架材料网眼内脂肪细胞较前增生明显(图8)。对照组同样可见炎性细胞浸润，伴有少量渗出性浆液，未见新生脂肪组织生成(图9)，支架材料8周时较4周时降解更加明显(图10、11)。
3讨论
做为组织工程研究理想的种子细胞，应具备容易获得、容易体外培养增殖、长期传代不改变生物学特征、抗原性小、组织修复能力强等特性。hUCMSCs来源于分娩后废弃的脐带，来源广泛，取材方便，易于收集、保存、冷冻，不存在伦理、道德和法律方面的争论与限制；它相对纯净，与干细胞输注相关的病毒与病原微生物感染率远低于骨髓移植；hUCMSCs形态呈现成纤维细胞样，在体外培养
体系中能快速增殖，传代后3～5天，能增殖4～5倍，传代10代以上细胞可增殖510倍，且增殖速度无明显降低，传代稳定。OCT-4是胚胎干细胞特异性基因，对维持干细胞未分化状态具有重要意义，RT-PCR检测结果显示，hUCMSCs阳性表达OCT-4mRNA[3-4]；hUCMSCs具有跨胚层向多组织细胞分化的潜能和自我更新的高增殖能力，在不同诱导条件下，能够向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等分化；hUCMSCs不表达或低表达移植排斥相关标记，免疫原性低，属免役缺陷细胞[5]。有鉴于此，说明hUCMSCs是一种理想的用于组织工程研究的种子细胞。
以hUCMSCs为种子细胞构建组织工程脂肪的基础是寻找一种具有良好生物相容性和可降解性的三维支架材料，因此选择适宜于hUCMSCs立体培养的支架是脂肪组织工程的基本条件之一。研究表明，蚕丝蛋白主要由3/4丝素和1/4丝胶两种蛋白组成，具有良好的机械强度和柔软性，丝素具有良好的生物相容性及生物降解性，其来源丰富，价格便宜[6-7]。所以，本研究选择蚕丝蛋白做为hUCMSCs的天然支架材料，将其制备成孔径50～60μm的支架[1]，在体外将hUCMSCs接种于支架材料上, 通过荧光倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞伸展、黏附和生长过程。结果显示, hUCMSCs生长状态良好, 在常规培养条件下，可以正常生长增殖、迁移并分泌细胞外基质，表明蚕丝蛋白支架有利蚕丝蛋白的正常生长[2]。
前期实验研究的基础上，采用将hUCMSCs与蚕丝蛋白支架材料复合培养10天的方法，可使hUCMSCs在支架材料上进一步扩增，成脂诱导6周后，在体外可初步构建出组织工程脂肪样组织。进一步将这种体外构建出的组织进行体内移植，观察其演变过程。结果表明：随着时间的推移，蚕丝蛋白多孔支架网眼内脂肪细胞逐渐增多，而且，蚕丝蛋白多孔支架在体内呈现逐步降解趋势 ......
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