靶向人VEGF165的SiRNA慢病毒的构建和鉴定(2)
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参见附件(1982KB，3页)。
1.2.3 滴度测定：在96 孔板中接种293T细胞，每个孔加4×104。培养24h后将LV-SiVEGF及LV-NC浓缩液用DMEM培养液稀释成每100μl 中含10μl、 1μl、 10-1μl、10-2μl、10-3μl、10-4μl、10-5μl、10-6μl几个浓度梯度的病毒液，取100μl稀释后的病毒液分别感染293T细胞。培养24h后更换新鲜完全培养基继续培养，4 天后，用倒置荧光显微镜(尼康公司Ti-U)观察荧光表达情况。带有荧光的细胞数除以病毒原液量计算病毒的滴度。
1.2.4 感染HUVEC细胞：HUVEC细胞用含10%胎牛血清的1640培养基培养,用胰酶消化后接种于24孔板内，每孔4×104,培养24h, 分为干扰组、对照组、空白细胞组，待细胞密度达30%左右时弃培养液，按照MOI值为50分别加入适量的病毒溶液LV-SiVEGF、LV-NC及DMEM培养基,8h后更换新鲜的完全培养基继续培养。96h后在倒置荧光显微镜下观察荧光表达。
1.2.5 RT-PCR：每组收集一批细胞行RT-PCR测定VEGF基因 mRNA表达情况。用Trizol试剂提取细胞总RNA，以Takara公司反转录试剂盒，按照试剂盒说明书操作，取1ug总RNA反转成cDNA，采用SYBR Green 染料法在荧光定量PCR仪(Agilent公司 Mx3005P)上检测目的基因的表达。设计引物为：上游5'-cccactgaggagtccaacat-3'，下游：5'-tttcttg cgctttcgttttt-3'。定量PCR反应程序：95℃、10 min；变性95℃、15 S；退火55℃、30 S反应45个循环，延伸72℃10min；扩增完毕后，进行熔解曲线分析，95℃、1min，65℃、1min，以0.10℃/S的速度升温到95℃，连续监测荧光。扩增结束后分析熔解曲线，在熔解曲线上以具有单峰判断PCR扩增的单一性。同时设无模板对照，每份标本行3次Real-time PCR检测，取平均值。用随机附带的软件进行目的基因的相对定量表达分析。
2结果
2.1 慢病毒载体的鉴定：通过载体上的引物(F primer：5'- CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA -3')对扩增质粒进行测序，结果与设计的序列一致，表明慢病毒载体构建成功。
2.2 慢病毒滴度测定：共转染96h后在倒置荧光显微镜下观察，可见GFP的表达，随着病毒稀释倍数的增加表达绿色荧光的293T细胞数目越来越少(见图1)，从图片A-H依次为加入LV-SiVEGF浓缩液10μl、 1μl、 10-1μl、10-2μl、10-3μl、10-4μl、10-5μl、10-6μl几个浓度梯度，当稀释倍数为10-6时视野里有2个细胞表达GFP，因此LV-SiVEGF滴度测试的结果为2×109,即每毫升病毒浓缩液中含有2×109个病毒颗粒。同法测得LV-NC的滴度为5×109。
2.3 慢病毒载体感染HUVEC细胞： 病毒感染HUVEC细胞后96h观察荧光表达情况，通过在明场视野和荧光镜下的对比可估算LV-SiVEGF及LV-NC的感染效率均为80%左右(图2)。
2.4 基因干扰效率的检测：荧光定量检测VEGF基因扩增及溶解曲线照片见图3，溶解曲线为单峰说明产物单一。相对定量结果(图4)显示LV-SiVEGF感染的细胞组较之LV-NC组VEGF组显著降低，定量PCR检测结果干扰效率为73.3%
3讨论
3.1 血管内皮生长因子VEGF是目前研究发现最重要的血管生成因子，最初发现时由于其强大的促血管渗透作用而被称为血管渗透因子(vascular permeability factor，VPF)[6]。随着研究的深入，发现VEGF家族有多个成员，包括VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D，PDGF等[7]。VEGF家族成员通常是一种糖蛋白，是由两个亚基组成的同源二聚体。我们通常所说的VEGF及最初命名的VPF实际上是指VEGF-A。VEGF-A基因位于6号染色体的短臂上，它有8个外显子，选择性的剪切可以形成多个异构体，主要常见的成熟亚型有VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206，分别由121、145、165、189和206个氨基酸组成。VEGF-A在体内具有多重生物学作用，包括增加血管渗透性，诱导血管生成，血管发生，促进内皮细胞增殖、迁移，抑制血管内皮细胞凋亡等[8]。
3.2 研究表明增生期瘢痕具有丰富的血运，血管生成是增生性瘢痕形成的一个重要因素。而VEGF-A在这个过程中发挥着至关重要的作用，因此我们拟通过RNA干扰技术抑制VEGF-A的表达来抑制瘢痕增生。在VEGF-A的几种异构体中，VEGF165是目前已知对血管生成作用最强的细胞因子，因此本实验所设计的干扰的靶序列是针对的人VEGF165。
3.3 RNA干扰技术是基于转录后沉默机制，具有高效性和特异性，已被广泛应用于基因功能研究和药物研究。siRNA是发挥RNA干扰作用的分子，通过化学合成和体外转录发可以制备SiRNA，但SiRNA进入细胞易被RNA酶降解。因此通过质粒或病毒为载体介导的SiRNA可以克服以上缺点，前期我们已经制备了针对VEGF165的质粒，但是质粒转染效率低(转染效率小于10%)，持续时间短，脂质体对细胞毒性大。因此我们拟构建慢病毒介导的VEGF165干扰质粒，慢病毒属于逆转录病毒家族 ,能感染分裂期和非分裂期细胞 ,转染效率高、转染细胞稳定、病毒滴度高[9] ......
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