不同应力条件对体外培养成肌细胞命运的影响(2)
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1.3MTT检测存活细胞数：将上述实验的细胞消化离心后，稀释接种至96孔培养板中，每个处理孔接种3孔，每孔200μl。常规培养上述细胞4h，该过程细胞贴壁但又不发生增殖。加入MTT并呈色：每孔加入配置好的MTT溶液20μl，孵箱中继续孵育4h，吸弃培养孔中培养基，每孔加入200μl的DMSO。读数：用多功能酶标仪选择490nm波长，测定光吸收值(A)，测定前充分振荡。统计学分析、比较各组之间细胞相对数目的多少。
1.4RT-PCR：收获上述不同处理的细胞，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。4℃离心，12 000g×15min，取上清。加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12 000g×10min，弃上清。加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7 500g×5min，弃上清。晾干，加入适量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10～15min)。再根据说明书进行逆转录反应，PCR反应，琼脂糖凝胶电泳。
1.5 Western Blot：细胞实验结束后，去除培养液，冰上预冷的PBS清洗2～3遍，加入适量的冰预冷的、加有蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的细胞裂解液后置于冰上20～30min；细胞刮适当刮取细胞；12 000g离心，4℃，2min；取少量上清进行定量，余下的样品加loading buffer沸水中煮沸5min。根据蛋白定量结果，确定上样量，以备电泳使用。电泳，转膜，卸胶，转膜，封闭。一抗孵育，二抗孵育，蛋白检测。
1.6 统计方法：所有结果以x±s表示，两组间比较采用t检验；多组间比较，采用卡方检验。
2结果
2.1 体外培养C2C12成肌细胞。如图1。
2.2 不同周期性拉伸引起细胞存活细胞数目的变化：为了研究周期性拉伸力的幅度对细胞存活情况的影响，我们首先通过台盼蓝拒染实验和MTT法粗略检测了细胞的存活情况。MTT结果显示(图2)，低幅度的拉伸力(5%和10%)使得细胞存活数目增多(虽然没有统计学意义，但5%的拉伸条件下细胞数目较10%多)，而随着拉伸力的增加，细胞数目转而出现下降，当拉伸条件为15%及20%时，细胞数目显著降低至低于对照。由此可见，较大幅度的拉伸显著降低细胞存活率。台盼蓝拒染实验得出类似的结果。
2.3 较低幅度的应力抑制成肌细胞的分化并促进其增殖：细胞增殖和细胞分化是一种矛盾统一，为此，我们想探讨不同幅度的拉伸对细胞分化的影响。结果发现，在分化培养基条件下，低幅度拉伸细胞，细胞的分化标志分子，myogenin表达水平与对照相比，明显降低，尤以5%低幅度明显(图3)。以上结果表明，低幅度的拉伸可以抑制细胞的分化。
2.4 较强应力引起成肌细胞的凋亡：细胞的存活与细胞的增殖和细胞的凋亡相关，为了进一步探讨高强度拉伸条件下，细胞数目减少的原因是细胞增殖减少，还是细胞凋亡的增多。我们进一步通过DNA ladder实验和PARP剪切实验检测了细胞凋亡的情况。结果发现，随着拉伸幅度的增加，剪切型的PARP逐渐增多(图4)。
3讨论
3.1 口腔颌面部的畸形严重影响患者的身心健康和家庭幸福，功能矫治成为重要的治疗手段。面颌部肌肉组织的适应性变化在牙颌面畸形的矫治中扮演着重要角色。探讨矫形力对肌肉细胞的增殖、分化、凋亡的具体影响和分子机制，对进一步认识矫形治疗的分子机制以及合理利用矫形力提高临床预后具有重要意义。
3.2 成肌细胞是肌组织的前体细胞，在骨骼肌的稳态维持和肌肉组织创伤修复过程中扮演十分重要的作用[5]。这类成肌细胞在组织原位为卫星细胞，正常状况下肌卫星细胞处于相对静止和转录不活跃状态，但当机体遇到生长、重塑或肌肉损伤等刺激时，卫星细胞就被激活，增殖并分化成肌肉细胞[6]。这些细胞再融合进已存在的骨骼肌纤维中，或者彼此融合，形成新的肌纤维。而细胞系C2C12具有与成肌细胞类似的生物学行为和特征，常被用来进行成肌细胞功能学的实验[7]。
3.3 细胞增殖、分化、凋亡是器官发生和组织创伤修复和重建的重要的细胞行为，而应力条件下组织合理的重建对于矫形医学至关重要[8]。在组织重建过程中，我们一方面需要通过细胞增殖实现对缺损和损伤组织的修复，另一方面增殖的细胞又必须是有功能的，也就是说，新增殖的细胞必须经过成熟分化，否则这种增殖是无意义的。除此之外，在组织重建过程中，细胞的凋亡也是必不可少的，因为，有些丧失功能的细胞以及没有功能的细胞必须通过细胞凋亡的方式清除掉。总的来说，细胞增殖、分化、凋亡的和谐统一是组织重建的需要。为此，在临床实践过程中，我们必须合理使用矫形力(幅度和频率)，使得细胞的增殖、分化和凋亡向着我们需要的方向发展。本研究发现不同应力条件下，细胞的增殖、分化、凋亡的命运不同。低强度的应力拉伸促进了细胞的增殖，抑制了细胞的分化；而高强度的应力拉伸促进了细胞的凋亡。
据此，我们将在分化条件下培养成肌细胞，同时施加低强度应力刺激，观察成肌细胞分化标志myogenin等的表达变化，明确应力刺激对分化的影响[9]。应力改变细胞命运必然是通过基因的表达调控实现的，也就是说，低强度应力最终还是通过改变重要基因的表达改变细胞分化命运的。
3.4 值得提出的是，本部分实验只是体外的细胞学实验，具有很多局限性。首先，本部分实验仅仅采用细胞系C2C12，该细胞系被认为是成肌细胞，而它能否代表体内的卫星细胞，需要进一步实验证明[10]。而该细胞能否代表体内绝大多数的终末分化的肌肉细胞，就更需要验证。有研究表明，成肌细胞的凋亡和分化肌肉细胞的凋亡机制不尽相同。其次，在临床实践过程中，矫形力的作用分外复杂，除了对组织的拉伸以外，更有对组织的压迫，以及组织拉伸后，其后方组织空间位阻的减少。这些力学行为后细胞行为的改变都值得研究。拉伸研究的结果能否应用于压迫的研究，是一个非常有意义而又有待解决的重要问题。
[参考文献]
[1]Carranza ML,Carda C,Simbron A,et al.Morphology of the lateral pterygoid muscle associated to the mandibular condyle in the human prenatal stage[J] ......
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