Ad-EGFP修饰的MSCs在糖尿病足溃疡大鼠体内的示踪及疗效观察(2)
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1材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：SPF级Wistar大鼠5只，体质量(100 ±20)g，用于BMSCs的分离、培养；SPF级Wistar大鼠60只，体质量(200±20)g，均由甘肃省中医学院提供。
1.1.2 试剂及仪器：Ad-EGFP (本实验室构建)；DMEM-F12培养基和胰酶(GIBCO公司)；胎牛血清(兰州民海公司)；链脲菌素(STZ) ( Sigma公司)；血糖试剂盒(四川迈克科技公司)；CO2细胞培养箱(Heracell公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；荧光倒置显微镜(Olympus公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 大鼠MSCs的分离、培养及纯化：SPF级Wistar大鼠，(100 ±20)g，脱颈处死后，于超净工作台内无菌取出双侧股骨、胫骨，用DMEM-F12培养液冲出骨髓，采用全骨髓贴壁法培养，37℃、5% CO2孵箱内培养72 h后更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞，以后每3 天换液1次。待细胞长至80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，l:3比例传代。
1.2.2 重组腺病毒载体Ad-EGFP转染大鼠BMSCs：3代BMSCs接种于10mm培养皿，待生长至80%融合后，弃去上清，加入含Ad-EGFP腺病毒的DMEM-F12培养液(MOI=150)孵育2h后，将培养液更换为含5%FBS的DMEM-F12培养液，37℃、5%CO2孵箱培养，48h后荧光显微镜观察绿色荧光强度。
1.2.3 动物模型制备及细胞移植：60只SPF级Wistar大鼠，体重(200±20)g，雌雄各半，随机分为：糖尿病治疗组(糖尿病足溃疡大鼠细胞治疗组)、糖尿病对照组(糖尿病足溃疡大鼠PBS对照组)及正常对照组(正常足溃疡大鼠PBS对照组)。前两组高脂饲料(向标准混合饲料中添加含10%猪油、2.5%蛋黄及20%蔗糖高脂高糖成分)喂养2个月后，腹腔内注射链脲菌素1次(30mg/kg)，正常对照组采用标准混合饲料喂养2个月后，腹腔内注射等量柠檬酸缓冲液。一周后眼球后静脉丛采血测量血糖，空腹血糖 ≥16.7mmol/L视为大鼠糖尿病造模成功。3组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，足背部作一3mm×7mm的矩形切口并移除全层皮肤，视为足部溃疡造模成功(记为第0天)。于第1天，细胞移植组经尾静脉注射转染Ad-EGFP 72 h后的BMSCs悬液0.5ml(细胞数5×106个)，其余两组注射等量PBS溶液。
1.2.4 观察指标：①分别于细胞移植后7 天、14 天、21 天测量体重、空腹血糖水平及足部溃疡面积；②细胞移植后14 天，断颈处死，取胰腺、肾脏及溃疡创面新鲜组织，立即冰冻切片，片厚7μm，荧光显微镜下观察EGFP-BMSCs在胰腺、肾脏及溃疡局部的分布情况。
1.2.5 统计学方法：采用SPSS11.0统计软件对所测数据进行分析，计量资料用均数±标准差表示，两个均数比较用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1 Ad-EGFP转染大鼠BMSCs：应用Ad-EGFP转染大鼠BMSCs(MOI=150)，转染效率可达88%以上，转染48 h后，细胞荧光明显增强(图1)，荧光倒置显微镜下可见发绿色荧光的BMSCs呈宽大扁平形及梭形分布。荧光强度3～5 天达到顶峰，40 天后仍能观察到荧光。
2.2 移植后体重变化：正常对照组体重基本稳定，糖尿病对照组体重呈持续下降趋势。糖尿病治疗组在移植后7 天内体重呈下降趋势，14天已开始上升，至21天接近正常对照组水平，差异无统计学意义(P=0.098)；与糖尿病对照组相比差异有统计学意义(P<0.05) ；与细胞移植后7天相比，体重增加约18%，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。
2.3 移植后血糖变化：糖尿病治疗组血糖在移植后7 天内与糖尿病对照组相比尚无差异，14 天逐渐降至(19.68± 0.73)mmol/L，21 天降至(17.35±0.89) mmol/L，与0 天相比差异有统计学意义(P<0.05)；糖尿病对照组血糖稳定在较高水平，21 天达(25.32±1.67)mmol/L，与糖尿病治疗组相比差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病对照组及正常对照组血糖移植前后差异均无统计学意义(图3)。
2.4 移植后溃疡面积比较：见图4。由图可见，足溃疡造模当天(0 天)三组溃疡面积比较后无统计学差异，从7 天开始到21 天，正常对照组愈合情况明显优于糖尿病治疗组和糖尿病对照组(P<0.05)；14 天开始，糖尿病治疗组愈合效率开始高于糖尿病对照组(P<0.05)。
2.5 EGFP-BMSCs在胰腺、肾脏及溃疡局部的分布情况：细胞移植后14 天，糖尿病治疗组大鼠胰腺、肾脏及溃疡局部组织中出现Ad-EGFP标记的BMSCs细胞，提示BMSCs能定位于胰腺、肾脏及溃疡创面中，见图5～7。
3结论
BMSCs是自我更新能力极强的一类具有多向分化潜能的非造血干细胞，其具有免疫原性低，取材方便，体外增殖能力较强的优势，且具有调节炎症介质、旁分泌生长因子类物质及良好的归巢作用[2-3]，大量的基础研究和初步临床试验结果肯定了BMSCs移植对缺血性心肌疾病、骨、软骨、角膜、皮肤及软组织再生的治疗作用。Ezquer[4-5]等在STZ诱导糖尿病小鼠体内静脉移植BMSCs的实验研究中也证实了BMSCs可明显改善小鼠高血糖症状、促进胰岛β细胞再生及阻止肾脏损害；同时发现从糖尿病小鼠体内分离培养的干细胞与正常小鼠干细胞相比，存在细胞表型改变、成骨不良及增殖潜能明显减退的现象，为BMSCs治疗糖尿病提供了进一步的理论支持。治疗糖尿病难愈性创面的动物实验研究表明，BMSCs移植后能分泌血管源性因子及分化为血管内皮细胞，进而促进毛细血管新生，加速创面愈合[6-7]；国外用自体BMSCs移植治疗糖尿病足溃疡的临床试验也显示了较好的促溃疡愈合效果[8]。
本研究给予实验动物低剂量STZ破坏了部分胰岛β细胞功能，配合高脂饲料可造成外周组织对胰岛素不敏感 ......
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