破溃兔扩张皮瓣的细菌学研究(2)
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参见附件。
1.4 标本采集：采用直接标本采取(如图4)和试子擦拭标本采取两种方法
1.5 标本的处理
1.5.1 试子采取的标本的处理：分别进行涂片、接种于需氧培养基(普通血平皿、中国兰平皿)、厌氧血平皿和液体培养基中。
1.5.2 直接采取标本的处理：对各部分采取的标本，分别在无菌的条件下称重。各组分别用不同的无菌手术剪刀把切下组织剪成碎片，放入无菌研磨器中，每克加入1ml无菌营养肉汤，研磨成组织匀浆。然后进行定性或定量[3]细菌学检查。
1.6 细菌学检查：所有细菌学研究方面的操作，均由资深细菌学专家现场指导。细菌的分离、培养、鉴定均按《全国临床检验操作规程》和API鉴定条说明将细菌鉴定到种。质控菌株：大肠埃希菌(A TCC25922)、铜绿假单胞菌(A TCC27853)和金黄色葡萄球菌(A TCC25923) 。
1.7 统计分析：应用正版统计软件SPSS 12.0 进行统计分析，数据汇总与绘图则用Excel 2003。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)、精确概率法(Fisher's Exact Test)、t检验，χ2检验，检验水准α＝0.05。
2 实验结果
2.1 破溃扩张皮瓣模型形成时取下组织的细菌学结果：需氧菌和厌氧菌培养细菌学检测均为阴性。
2.2 细菌定量检查结果:A组细菌数量多为103CFU/g水平；B组多为103～104 CFU/g；C组多为105 CFU/g；D组以106 CFU/g水平以上为主。其结果如图5所示：
2.3 细菌定性检查结果：共检出56个菌株，需氧菌42株，其中G+菌株33株，占58.9%，G-菌株19株，占33.9%；厌氧菌4株，占7.2%。G+菌株中，金黄色葡萄球菌占45.5%； 表皮葡萄球菌占24.2%；粪肠球菌占12.1%，溶血性葡萄球菌和枯草芽胞杆菌分别占6.1%；乙型溶血性链球菌和假白喉棒状杆菌分别占3.0%。G-菌株中，铜绿假单孢菌42.1%，肺炎克雷伯菌占31.6%，大肠埃希菌15.7%，普通变形杆菌和阴沟肠杆菌各占5.3%。厌氧菌为厌氧消化链球菌和嗜酸乳杆菌，均见于4例出现感染的模型中，未出现感染的模型中未检测的厌氧菌。
2.4 定位检查：包膜基底未感染时：①破口周围炎症反应皮瓣组织内均有细菌存在,且数量最多；②环1组织细菌检测阳性率为57%,环2、环3和其他皮瓣组织细菌检测阳性率均为0，于环1差别显著(P﹤0.05)；③ 基底包膜复合组织细菌检查阴性。包膜基底感染时：皮瓣各部分均有细菌存在，基底部位数量最多。
2.5 药敏结果：G+菌株中，去甲万古霉素、提考拉宁敏感；G-菌株中，对亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素敏感；厌氧菌对甲硝唑敏感。
2.6 在两种取材方法阳性率的比较中，切取组织细菌培养方法出现的阳性率为100%，是比较可靠的方法，而试子擦拭法阳性率低，为20%，不太可靠。
3 讨论
3.1组织扩张术在外耳再造中的应用：组织扩张术由于可提供同质的薄、柔、有感觉的、血供良好的皮瓣，可使雕刻的外耳支架纤细结构充分展现，使再造耳更加逼真、自然,明显优于传统的方法[1-2]。但是，扩张皮瓣的破溃作为组织扩张术的并发症，是客观存在的，耳后扩张皮瓣破溃后，皮肤的完整性遭到破坏，是否有细菌入侵，目前尚未有相关的基础研究，但是已有临床研究观察到，扩张皮瓣破溃后可在某种程度上增加扩张过程中感染的发生率。另一方面，目前的观点是：若革兰士染色发现扩张包膜内有细菌存在，就避免放置永久性置入物，也就是说，外耳支架的受植床必须是无菌的，所以，研究扩张皮瓣破溃后的细菌状态就有非常重要的临床意义。
3.2 关于扩张皮瓣组织内细菌的研究 对于扩张皮瓣，主要是包膜内细菌存在与否，一直存在不同的观点[4]。根据我们大量的外耳再造临床实践证明，在扩张皮瓣保持完好的情况下，在正常的扩张注水无菌操作下，包膜腔内是处于无菌状态的。本实验在形成破溃动物模型时所做的细菌学检查亦在某种程度证实，扩张皮瓣完好的情况下，其受植床是无菌状态。对于扩张包膜内发现细菌存在的情况[4]，尚需进一步研究，或许Mason[5]报告的2例由于淋巴途径或血行途径导致的扩张器感染可以提供一点思路。
3.3 关于实验设计
3.3.1关于实验动物及部位的选择：兔是比较温顺和清洁的动物，兔的头部具有于人耳后乳突相似的解剖基础，保证了于临床的相似性；兔头部形成的扩张皮瓣位置固定，且不宜受到外伤，保证实验条件的对等性。
3.3.2关于取材：本实验取材分为两个阶段，其中第一阶段的目的是检测主体实验开始时，各组实验对象的实验条件是否一致，即细菌状态是否一致，并以此作为主体实验的对照。第二阶段是分部取材，因为破溃扩张皮瓣形成的创口，其底面是无机的、细菌不能通过的扩张器包囊，细菌只能通过创缘周围的皮瓣进入机体，进行增殖，引起局部炎症反应、或者播撒引起感染。因此，根据细菌的侵入途径，将整个扩张皮瓣进行分区，以明确细菌存在的方位。
3.3.3关于实验方法：目前，对于细菌学的检验，免疫组化、原位杂交和PCR等较高的特异性和敏感性的方法，仅限于对血液标本检测之用[6-7]，对于其他组织应用较少。国内外对临床标本中病原菌的检验大多仍采用本实验所用的方法--培养法这个“金标准”[8]。在定量检测方面国内外通用的Cooney法[3]。因此，总的来说，本实验选用的方法，是目前国内外临床上最为常用、可靠的方法。
3.4关于实验结果：本研究发现，扩张皮瓣破溃后，虽然革兰阳性菌是最常见的感染菌种(占45.5%)，但同时亦有G-菌株和厌氧菌。细菌计数表明随着破口持续时间的延长，皮瓣组织内侵入的细菌数量是呈增长态势，因此在临床上，出现耳后扩张皮瓣溃破后，要快速封闭破口，同时为了预防或控制细菌繁殖，可联合应用敏感抗生素，处理严重感染时，应该意识到厌氧菌的存在，从而快速而有效地控制感染。
4 展望
本实验首次针对临床遇到的情况进行了相关研究，为临床医生处理此种情况提供了一定的参考，但是，本研究有其固有的局限性，如何寻求一种更为快捷、准确、易于临床应用的检查手段，是本研究的发展方向。
[参考文献]
[1]庄洪兴,蒋海越，潘博,等.先天性小耳畸形的皮肤软组织扩张器法外耳再造术[J].中华整形外科杂志，2006，12(4)：286-289.
[2]Jiang H，Pan B，Lin L,et a1.Ten-year experiencs in microtia reconstruction using tissue expander and autogenous cartilage[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 2008，72(8)：1251-1259.
[3]张秀珍. 当代细菌检验与临床[M]. 北京：人民卫生出版社, 1999:231-33.
[4]Brown MH,Markus YM,Belchetz B. Microbial growth in saline breast implants and saline tissue expanders[J] ......
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