核因子κB在烧伤血清诱导血管内皮细胞损伤中的作用(2)
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参见附件。
1.3.3 蛋白印迹法(Western-Blot)检测相关分子蛋白表达水平：弃去培养液，用0.125% 胰酶消化，离心收集细胞，按试剂盒步骤依次提取细胞浆和细胞核蛋白, 4，4′-二羧酸-2，2′-二喹啉法测定细胞总蛋白浓度。取等量样本行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转膜、封闭，将膜与一抗在4℃共同孵育过夜，漂洗后与辣根过氧化物酶标记的二抗共同孵育，在暗室中化学发光后经凝胶成像系统扫描并分析。
1.4统计学处理：采用SPSS10.0统计软件处理数据，数据以 x±s表示，均数比较采用单因素方差分析, 以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞培养及鉴定 传代后脐静脉内皮细胞24h内全部贴壁,细胞呈多角形或鹅卵石状，台盼蓝染色判断细胞活力,活细胞比率大于95%；Ⅷ因子免疫组化染色,镜下可见98%以上细胞染色呈阳性。
2.2 MTT细胞活力检测 刺激1 h后采用MTT法检测细胞活力。A组细胞OD 值为(0.152±0.011)。与A组相比，B组(0.121±0.010)细胞活力降低(P<0.05)，C组(0.143±0.012)其OD值较B组明显升高(P<0.05), 心肌细胞活力提高。
2.3 流式细胞仪凋亡检测A组细胞凋亡率为(13.7±2.2)%。与A组相比，B组(34.5±2.3)%细胞凋亡率均明显升高(P<0.01)。与B组相比，C组(21.9±2.5)% 细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。
2.4细胞核NF-κB-p65的蛋白表达水平 A组细胞胞核NF-κB-p65的蛋白表达水平较低。与A组相比，B组细胞胞核NF-κB-p65的蛋白表达水平明显升高。与B组相比，C组细胞胞核NF-κB-p65的蛋白表达水平明显减少。见图1。
3 讨论
核转录因子指一类能和某些特定基因启动子区固定核苷酸序列结合从而启动该基因转录的蛋白质。NF-κB 是其中一种具有多向性调节作用的核转录因子，也是多种信号传导途径的汇聚点，在调节机体免疫、炎症、细胞再生、凋亡等过程中发挥关键作用[3]。NF-κB由p50和p65亚基形成二聚体，在静息状态下，NF-κB与κB抑制蛋白IκB(以IκB-α最为重要)结合以无活性方式存在于胞质中。当细胞受到外界刺激时(如肿瘤坏死因子α、脂多糖、氧化剂、蛋白激酶激活剂等)，IκB发生磷酸化而降解，使NF-κB与其解离并迅速发生核移位，发挥转录活性[4]。严重烧伤患者早期血清中多种炎症因子普遍升高，已有研究报道NF-κB信号通路是烧伤血清刺激下内皮细胞结构与功能紊乱的中心环节之一[2]。本实验结果显示，空白对照组内皮细胞胞核几乎无NF-κB阳性表达，烧伤血清刺激1h后细胞胞核NF-κB表达增强，与其变化趋势相一致的是内皮细胞损伤明显、细胞凋亡显著增加；而给予NF-κB特异性阻断剂预处理，伴随着烧伤血清刺激后细胞胞核NF-κB表达回落，内皮细胞损伤及细胞凋亡也显著减轻。说明内皮细胞NF-κB在烧伤血清诱导下发生明显核移位并可能在内皮细胞损伤中扮演重要角色。
防治严重烧伤后内皮细胞损伤, 维护内环境稳定一直是烧伤防治的一个重点。本研究初步证实NF-κB参与严重烧伤后内皮细胞损伤, 因此，采取阻断NF-κB的策略对于防治严重烧伤后内皮损伤可能具有一定的潜在意义, 深入探索具有靶细胞特异性和对不同NF-κB成员具有选择性的细胞内NF-κB活化阻断剂，可能是防治严重烧伤后内皮细胞功能紊乱的一个重要方向。
[参考文献]
[1]杨宗城. 烧伤后血管内皮细胞损伤及其在早期脏器损害中的作用[J].中华烧伤杂志,2001,17(3): 133-135.
[2]Chen XL,Xia ZF,Wei D, et al. Expression and regulation of vascular cell adhesion molecule-1 in human umbilical vein endothelial cells induced by sera from severely burned patients[J] ......
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