阻断Notch信号抑制角质形成细胞的分泌功能的研究(2)
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参见附件。
1.2.1 角质形成细胞培养： 冻存的角质形成细胞以1 000～5 000细胞/cm2密度复苏后培养于无血清的KGM完全培养基中, 当细胞达到70%～80%融合，利用0.02%胰酶和0.05%EDTA进行消化传代，直到第四代细胞用于血清刺激模型建立。
1.2.2 血清刺激模型建立及DAPT处理： 将角质形成细胞在KGM成基础培养基中静置17h，加入或不加10μM DAPT，孵育2h后，加入10%FCS，于血清刺激后0h、1h、6h、12h及24h收集细胞及培养上清。
1.2.3 Real-time PCR检测：采用TriPure试剂按说明书进行RNA提取。DNase I 37℃，10～3Omin，以去除基因组DNA污染。RNA沉淀，重悬后进行定量。利用反转录试剂盒按照说明书对RNA进行反转录。采用SYBR Green I染料在MJ Research 0ption 2荧光定量PCR仪上检测目的基因的表达。PCR反应体系20μl。PCR反应条件：激活95℃，10 min；40个循环，变性95℃，15 s；退火55℃，30 s，延伸72℃，30 s；分别在78℃、80℃、82℃和85℃时检测荧光。扩增完毕后，进行熔解曲线分析，95℃，1 min，65℃，l min，以0.10℃/s的速度升温到95℃，连续监测荧光。扩增结束后分析熔解曲线，在熔解曲线上以具有单峰判断PCR扩增的单一性。同时设无模板对照，每份标本行3次Rea1-time PCR检测，取平均值。对cDNA模板进行倍比稀释，以1.0×、0.5×、0.25×、0.125×四个浓度梯度的cDNA模板进行Rea1-time PCR扩增。将不同浓度模板的对数和相应到达阈值的循环数(ct值)作图，做标准曲线。基因mRNA表达采用直线相关回归分析，管家基因GAPDH的表达量作为内参照，分析目的基因的相对表达量。
1.2.4统计学处理：应用STAT4.0软件进行统计分析，用方差分析处理数据。
2 结果
2.1 血清可以明显刺激角质形成细胞Notch信号相关分子的表达与活化。血清刺激后，Notch1及Jagged1表达明显上升，并呈现时间依赖性。此外，Notch下游分子，P21表达明显升高，并在血清刺激后6h达到高峰(P=0.0004)；P63表达下降，并在血清刺激后6h下降幅度最大(P<0.0001)。
2.2 血清明显刺激纤维化相关因子的表达。由于给予细胞的是单次血清刺激，所以我们只能短时间观察纤维化相关因子表达变化。其中TGF-β2、IGF-1、CTGF及EGF于血清刺激后12hmRNA表达高峰，到24h表达开始下降；而TGF-β1表达缓慢升高，直到血清刺激24h尚未出现明显表达高峰；VEGF于血清刺激后1h即出现了明显的高表达。
2.3 阻断Notch信号抑制了纤维化相关因子的表达。由于我们在给予血清刺激前2h及对细胞进行了DAPT处理，因此血清刺激0h，Notch信号下游分子及纤维化相关因子表达即出现不同的表达差异。DAPT明显抑制了P21表达，1h即达到了最大的抑制作用(P<0.0001)；DAPT处理后，P63表达明显升高，12h升高作用达到最大(P<0.0001)。TGF-β2(P=0.0147)、IGF-1(P<0.0001)、CTGF(P<0.0001)及EGF(P=0.0004)于血清刺激12h，DAPT的抑制作用达到最大；TGF-β1(P=0.0003)及VEGF(P=0.0033)于血清刺激1h，DAPT即有明显抑制作用。
3讨论
Notch信号通路是人体重要信号通路之一，其信号分子在机体内的各个器官中均有表达，调节细胞周期、细胞增殖及凋亡。皮肤作为人体重要的器官，Notch及其配体在表皮细胞的多种细胞均有大量表达，且特异性的Notch信号活化在维持皮肤细胞自身更新及分化过程中起到重要意义。
人类细胞的Notch存在五种配体：Delta like1，Delta like3，Delta like 4，Jagged1及Jagged2；及四种受体：即Notch1、Notch2、Notch3及Notch4。在人表皮中，各层表皮细胞均有Notch1分子表达，但Notch2只表达在基底细胞表面，而且Notch配体(例如：Jagged和Delta-like家族)与Notch受体作用是交叉的[8-9]。尽管Notch配体和受体的表达模式有差异，但通过对人类和小鼠的角质形成细胞研究结果表明，任何配体激活的Notch信号都具有诱导分化的能力[10-11]。Notch在表皮的研究中，主要集中的Notch信号对表皮增殖及分化的调节作用的研究。在表皮，Notch信号活化后，直接诱导其下游分子P21表达，抑制P63表达，进而诱导表皮分化，抑制表皮增殖。P21具有调节细胞周期的功能，也被称为Waf-1和Cip-1[10]。P21的表达增多会导致正在增殖的角质形成细胞出现细胞周期停滞，进而促进细胞向终末期细胞分化；而P63在维持表皮的增殖能力中起着重要作用。在Notch信号对病理性瘢痕的作用研究中发现，增生性瘢痕组织中出现角质形成细胞的过渡分化，其原因可能与Notch1和Jagged1在角质形成细胞过表达引起P21表达上调P63表达下调有关[11]。
表皮的分泌功能在皮肤的病理生理过程中都起到了重要作用。大量的研究表明，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的表皮常常会大量的分泌纤维化生长因子(包括TGF-β、CTGF、IGF-1、EGF、VEGF、PDGF、bFGF 等)，这些生长因子透过基底膜到达真皮，进而促进真皮成纤维细胞的增殖及胶原合成，导致瘢痕增生[12-14]。但是关于Notch信号对表皮分泌功能的影响目前尚未见报道。而我们利用血清刺激模型进行的体外研究发现，阻断Notch信号后，不仅抑制了血清刺激的表皮的增殖能力下降及过度分化状态 ......
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