十精丸对UVA致ESF-1细胞光老化保护作用的研究(2)
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1.2.2 成纤维细胞ESF-1的体外培养：皮肤成纤维细胞ESF-1在含有10%胎牛血清的DMEM，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。取对数生长期的细胞以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，调整其密度为105个/ml，定量接种于96孔板中备用。
1.2.3 细胞光老化模型的建立：根据文献[2]计算紫外线的照射剂量，照射剂量(J/cm2)=照射强度(W/cm2)×照射时间(s)，照射强度通过紫外线辐照计测量来测量。
按照文献[3-5]方法，将处于对数生长期的细胞接种于96孔板，待细胞单层贴壁后(24h)，弃培养液，每孔加入150μl PBS，分别使用40J/cm2的UVA照射，正常组用铝箔盖住。
1.2.4 实验分组：按照预实验结果，将处于对数生长期的细胞接种于96孔板，随机分为正常对照组、模型对照组、十精丸水提液低(50μg/ml)、中(100μg/ml)、高(200μg/ml)剂量组。接种24h后各组弃培养液，每孔加入150μl PBS，除正常对照组外，按照2.3的方式造模。照光后弃去PBS，药物组加入含药的DMEM培养基，对照组加入不含药DMEM培养基，继续培养。以上各组细胞每组设6个复孔。
1.2.5 MTT检测细胞活力：五组均进行以下操作：接种于96孔板中的细胞，在第48h向每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，继续培养，4h后弃上清，每孔加150μl DMSO溶解，室温，振荡10min，使结晶溶解，酶标仪检测各孔492nm处的光吸收(OD)值，然后按公式(1)计算细胞活力：
1.2.6 检测细胞培养液中SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量：严格按照检SOD、GSH-Px和MDA试剂盒说明书操作。
1.2.7 统计学方法：用SPSS13.0软件对结果进行统计分析，各组数据以x±s表示，多样本间的方差分析采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 十精丸水提液对ESF-1细胞细胞活力的影响：见表1。由表1得，模型对照组与正常对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，说明模型制作成功。十精丸水提液各剂量组OD值均高于模型对照组，且在此剂量范围内，随着浓度的增加呈升高的趋势。十精丸水提液中、高剂量组与模型对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
2.2 十精丸水提液对ESF-1细胞SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量的影响：见表2。由表2得，与正常对照组相比，模型对照组的SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组相比较，十精丸水提液各剂量组均能提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量；且十精丸水提液中、高剂量组与模型对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
3 讨论
3.1 日光中的紫外线(UV)是引起皮肤损伤的主要环境因素，它可增加皮肤组织中的氧自由基，引起氧化损伤，同时可引起局部和系统免疫抑制和细胞凋亡，造成DNA损伤诱发突变，导致皮肤炎症、晒伤、光老化及皮肤肿瘤[1]。辐射到地面的UV主要是UVA(320～400nm)和少量UVB(290～320nm)，以往研究多集中于中波紫外线对人皮肤的损伤，而对长波紫外线UVA(320～400nm)的研究较少。阳光紫外线中所含的UVA具有很强的穿透作用(大约1 mm)，可影响位于真皮层的成纤维细胞[6]，影响皮肤胶原合成，进而引起皮肤光老化。目前从天然植物和传统药物中开发防皮肤光老化药物已成为国内外研究热点[7]。
3.2 十精丸出自明代《普济方·卷二百二十三·诸虚门·补虚驻颜色附论》，由枸杞、熟地、桂心(肉桂)、菊花、山茱萸、菟丝子、肉苁蓉、蜀椒、柏子仁、白茯苓(茯苓)十味中药组成。是中医美容保健、延年益寿之传统名方。其功效为“温肾滋肾，益精填髓，养心益智、平肝明目；乌须发，悦容颜，久服能轻身延年”。从以往的理论和研究看[8]，该方具有抗皮肤光老化，缓解紫外线对皮肤细胞损伤的潜在功效。在此笔者对十精丸水提液对UVA诱导的人皮肤成纤维细胞损伤的保护作用进行了初步研究。
3.3实验结果表明，40J/cm2的UVA照射导致ESF-1细胞SOD和GSH-Px的活性显著下降， MDA含量明显升高，细胞活力下降，证实了UVA可降低人真皮组织细胞清除和防御ROS的能力并导致氧化损伤。十精丸水提液低剂量组(50μg/ml)保护ESF-1细胞免受UVA损伤的作用效果不明显；中(100μg/ml)、高剂量组(200μg/ml)均能显著提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，增强细胞活力，有效地对抗UVA对成纤维细胞氧化性损伤。
综上，十精丸可明显保护人成纤维细胞ESF-1免于UVA损伤，其具体机制可能与抑制氧化损伤和增强细胞抗氧化能力有关。本研究结果为开发天然光防护剂提供了理论依据，丰富十精丸抗皮肤光老化的理论研究，为其临床应用奠定基础。
[参考文献]
[1]Ichihashi M,Ueda M, Budiyanto A,et al. UV-induced skin damage[J].Toxicology,2003,189:21-39.
[2]李薇.长波紫外线对人角质形成细胞和成纤维细胞的形态、数目及诱导型一氧化氮合酶表达的影响[D] ......
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