静脉移植骨髓间充质干细胞参与皮肤扩张的可行性研究(2)
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参见附件。
1.2.1 BM-MSCs的分离、培养：无菌条件下解剖乳猪双侧股骨，用PBS冲出骨髓，1.077g/ml Ficoll分离液分离(1500rpm，30min)，取界面单核细胞层离心洗涤后接种于含完全培养基(DMEM +10%胎牛血清)的培养瓶中，于37℃，5%CO2饱和湿度的孵箱内培养，48h换液，待贴壁细胞培养达80%～90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。
1.2.2流式鉴定BM-MSCs及细胞标记：取培养至第三代的BM-MSCs，0.25%胰酶消化，400μl的PBS重悬，调整细胞浓度为5×105/ml，分别加入FITC标记的鼠抗猪CD90、CD34、CD45、CD29抗体，4℃避光孵育30min，PBS重悬后上流式细胞仪检测。传代后的BM-MSCs加入2μg/ml的CM-DiI溶液孵育，PBS洗涤后制成含细胞数量约25×106/ml的单细胞悬液。
1.2.3实验分组：A组：植入扩张器后，耳缘静脉注射DiI标记的MSCs细胞悬液6ml，含细胞约1.5×108；B组：植入扩张器后，耳源静脉缓慢注射PBS 6ml。
1.2.4 扩张模型：小型猪用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在脊柱两侧各设计3个皮瓣，皮瓣中心上文出4cm×4cm大小面积。距脊柱2cm作纵行切口，深达深筋膜，按扩张器基底部大小在深筋膜浅层分离出4cm×6cm的皮下腔隙，置入80ml矩形单向扩张器，分层缝合皮肤。各组每隔三天注水一次，每次注水10ml。
1.2.5 扩张面积的测定：扩张后第7、14、28天分别测量两组标记面积，共48个扩张皮瓣，每组每个时间点扩张皮瓣为8个。应用统计学方法，比较两组皮肤的扩张面积。
1.2.6 冰冻切片观察DiI细胞的比例和分布：分别取两组扩张后第7，14，28天的新鲜皮肤标本，连续冰冻切片，荧光显微镜下(200×)避光观察DiI细胞在扩张皮肤中的比例和定位。
1.2.7 SDF-1在扩张局部表达量的观察：取各组扩张第14天的皮肤组织，提取总RNA后常规反转录，半定量PCR检测引物的特异性，荧光定量PCR分析目的基因趋化生长因子SDF-1相对表达量。以GAPDH为内参。
1.2.8 统计方法：数据均采用均数±标准差(x±s)表示，用SPSS16.0版统计软件对数据进行方差分析，而两两之间的比较采用独立样本参数t检验，P<0.05为差异有显著的统计学意义。
2 结果
2.1 BM-MSCs的培养、鉴定结果：体外培养的BM-MSCs呈多角形或梭形，12天左右细胞达到单层汇合的80%～90%。流式细胞检测结果表明BM-MSCs不表达CD34和CD45，但表达CD29和CD90。
2.2 BM-MSCs标记结果：CM-DiI染色标记传代后的细胞，用计数板计数，比较同视野白光及荧光下细胞数目，可见细胞均匀分布，荧光明亮，细胞标记率>99%。
2.3 面积测定：随着扩张时间延长，两组扩张皮瓣的标记面积增加，且实验组增加较多，扩张第28天，A、B两组扩张面积分别为(32.54±0.88)cm2、(30.11±0.58)cm2(P<0.05)。
2.4 扩张皮肤冰冻切片结果：分别取两组扩张第7、14、28天皮肤，连续冰冻切片观察，结果显示A组扩张皮肤第7天仅见少量CM-DiI标记细胞分布，14天时可见CM-DiI标记细胞聚集，随着扩张时间延长，标记细胞增多，主要分布在真皮层。B组皮肤内未见标记细胞(图1)。
2.5SDF-1在扩张局部的表达量结果：半定量PCR检测结果：目的基因条带亮度A组高于B组(图2)。实时定量PCR检测结果：A组SDF-1的表达量为B组的5.8倍(P<0.05)。以GAPDH为内参(图3)。
3 讨论
3.1 近年来，骨髓间充质干细胞由于其多项分化能力、低免疫源性、易获得培养等优点成为再生医学研究的热点[1-2]。在皮肤创伤修复方面，大量研究证实移植的BM-MSCs参与皮肤的损伤修复过程[3-6]，BM-MSCs有很好的可塑性，能够动员到受损组织局部，成为结构组成细胞[7-8]，国内外大量研究证实移植到创面上的异体BM-MSCs能够通过分化为皮肤细胞和分泌生长因子促进创面愈合[9]。Yaojiong wu和liwen chen等的研究也证实了静脉给予的异体BM-MSCs通过分化和旁分泌作用促进了伤口愈合和皮肤新生[10]。有研究表明间充质干细胞会向缺氧环境迁移[11]，扩张皮肤在扩张期处于缺氧状态，因而极有可能趋化BM-MSCs到扩张区域。本实验通过将CM-DiI荧光标记的BM-MSCs静脉移植入皮肤扩张模型，旨在探讨异体移植的BM-MSCs能否迁移至扩张区域并促进扩张局部皮肤的新生。
3.2 CM-DiI是一种亲脂性荧光染料，易嵌入生物质膜内而标记整个细胞膜[12]。CM-DiI标记对细胞的活性、发育或其它基本的生理特性无明显影响[13]，不容易在标记与非标记细胞之间传递，且荧光保持时间长，可作为体外培养细胞所特有的标记物以区分在体细胞。本实验采用CM-DiI标记猪 BM-MSCs后，结果显示标记效率达99%，细胞在荧光显微镜下发出明亮的红色荧光，于标记后 28天仍然保持较清楚的荧光，也证实了移植的BM-MSCs向扩张区域的迁移。
3.3 众多体内外实验表明细胞因子可以影响干细胞移植的微环境[14]，进而影响骨髓间充质干细胞的动员、迁移及分化。基质细胞衍生因子-1属于趋化因子之一，具有广泛的生物学活性。研究证实SDF-1能够充当骨髓干细胞定向迁移的化学引诱物[15]，同时它也可以增强骨髓干细胞的运动能力[16]，Lee等[17]体外实验也发现，基质细胞衍生因子-1诱导骨髓间充质干细胞向其趋向迁移。本实验结果显示移植细胞组SDF-1分泌量较对照组增高，从而诱导移植的BM-MSCs向扩张区域迁移，在局部起到促进扩张皮肤新生的作用 ......
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