遗传性小耳畸形家系FGF3基因启动子甲基化检测及意义(1)
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[摘要]目的：探讨遗传性小耳畸形家系FGF3基因启动子区域甲基化状态及意义。方法：应用甲基化特异性PCR(MSP)法检测遗传性小耳畸形患者及其直系亲属的FGF3基因启动子甲基化32例，同时以20例健康者为对照。结果：遗传性小耳畸形患者及直系亲属FGF3基因启动子甲基化状态明显低于对照组，且有显著性差异(P<0.01)。遗传性小耳畸形家系组中，患病者的基因甲基化程度小于耳廓正常者(P<0.05).结论：FGF3基因启动子的甲基化状态可能与遗传性小耳畸形的发生有关。
[关键词]先天性小耳畸形家族；FGF3基因；甲基化
[中图分类号]R764.7 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2012)04-0611-02
Study of methylation of promoter of FGF3 gene in genetic microtia pedigree
LIU Jia-feng,SUN Jia-ming,LI Xiao-dan
(The department of plastic and reconstruction, Union hospital ,Tongji medical college, Huazhong science &technique university,Wuhan 430022,China)
Abstract: Objective To explore the methylation in promoter of FGF3 gene in genetic microfia pedigree. Methods The methylation in FGF3 gene in 32 people of genetic microtia pedigree and 20 healthy controls were measured using Methylation-specific PCR(MSP). Results The methylation of FGF3 gene in microtia were significantly lower than those in control(P<0.01).In the genetic microtia pedigree,the methylation of FGF3 gene in the patients were significantly lower than those in the healthy people(P<0.05). Conclusions Hypomethylation of FGF3 gene may related to the pathogenesis of genetic microtia.
Key words:Genetic mierotia pedigree;FGF3 gene;Methylation
小耳畸形是常见的先天性疾病，对其基因学的研究虽有一定的定位，然而，目前仍未明确某个基因的改变必然引起小耳畸形的发生。FGF3是脊椎动物头部软骨形成的关键调节因子，FGF3及FGFR2基因的突变可能导致在胚胎时期软骨细胞分化及迁移的障碍，有学者发现一家系FGF3基因上存在三个纯合子突变，并认为该突变与内耳发育不良及小耳畸形有密切相关[1]，而FGF3基因启动子甲基化状体及其在遗传性小耳畸形发生中的作用至今仍未见报道，本文拟通过对遗传性小耳畸形家系的研究，了解家系成员中FGF3基因启动子甲基化状态及其在小耳畸形发生中的作用。
1 资料和方法
1.1 研究对象：选取2007年7月～2011年7月在华中科技大学同济医学院附属协和医院整形外科就诊的遗传性小耳畸形家系4个，选其健在的直系亲属32人进行研究，其中男性19人，女性13人，年龄5～57岁。选择同期就诊的耳廓正常、无其他先天性畸形家族史的患者20例为对照。
1.2 实验方法
1.2.1标本采集及DNA提取：抽取两组病例空腹静脉血6ml,4℃保存备用，血标本收集完成后，提取血样中的DNA，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检。质检合格的DNA将浓度调整后，置-20℃储存备用。
1.2.2 亚硫酸氢钠处理基因组DNA：参照甲基化特异性PCR方法，用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，用2.5倍体积预冷无水乙醇和2μl糖原沉淀DNA，-40℃ 过夜；然后用70%乙醇洗涤沉淀2次，干燥后用30μl去离子水溶解，-4O℃ 保存。
1.2.3 甲基化特异性PCR：设计FGF3基因甲基化引物正义链和反义链，非甲基化引物的正义链及反义链。总体积为30μl反应液中含DNA 5μl，10×缓冲液3μl，MgCl22.5mmol/L，引物0.5μmol/L，dNTP250μmol/L，Hotstar Taq 0.5μl。MSP反应条件：95℃,15min，95℃, 30 S，60℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃ 延伸10min。
1.3 统计学方法：采用SPSS11.5软件统计数据，血浆FGF基因甲基化分析采用χ2检验，P≤O.05为差异有统计学意义。
2 结果
实验组血浆FGF3基因甲基化程度明显小于对照组(P<0.01),实验组中，患病者的基因甲基化程度小于耳廓正常者(P<0.05)。
3 讨论
3.1 先天性小耳畸形是常见的先天性疾病，其发病率较高，约1/7 000[2],它主要因为胚胎时期第一鳃沟及其邻近的第1、2鳃弓的发育异常引起的一组颌面畸形，主要表现为外耳及中耳的异常，传导性或混合性耳聋，有时伴有耳前凹陷或副耳[3-4]。其病因尚不明确，环境和遗传是重要发病因素，遗传因素虽不是小耳畸形的主要致病因素，但目前家族遗传性小耳畸形的报道并不鲜见[5-6] ......
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