胎猪脱细胞主动脉作为小口径组织工程血管替代物的体内试验研究(2)
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1.4 术后观测：移植术后观测手术区域有无出血及血肿形成，动物有无发热、呼吸急促等生命体征的变化，并给予及时的处理。术后定期观察实验动物的生存状态，分别于术后10天、1个月，3个月及6个月的时期利用彩色多普勒进行血流通畅度的观测。
1.5 Ⅱ期手术：在确定移植入的血管支架已基本被宿主所接纳(无明显排斥反应)；血流通畅度良好；支架与正常血管的吻合处管壁内表面光滑后(约6个月后)，再次手术取出移植处的血管组织。术前准备同Ⅰ期手术；在原切口附近再次切开，剥离粘连组织，并切取移植入的支架血管和两端少许正常血管组织(颈总动脉处两个残留的断端直接进行结扎止血)；立即用肝素冲洗管腔，再将组织置于生理盐水中清洗；沿纵轴小心地将管腔剖开，再分别将组织置于10%中性甲醛和1%戊二醛溶液中4℃条件下保存，为下一步的组织学染色及电镜观察做准备。
1.6 组织学染色：将标本置于10%中性甲醛溶液中固定24h，常规石蜡包埋、切片，进行HE染色。在光学显微镜下对标本的结构进行组织学评价。
1.7 电镜观察：将标本在1%戊二醛溶液中固定24h，之后用1%锇酸作后固定2h;50%、70%、90%、100%丙酮梯度脱水，每级10min；50%、70%、90%、100%醋酸异戊酯置换， 每级10min;应用临界点干燥仪、液体CO2等进行干燥；干燥的标本固定在铝质标本台上，用溅射镀膜机镀金后，用扫描电镜系统观察并照相。透射电镜样本先用0.1%戊二醛和0.16mmol/L的二甲砷酸钠缓冲液预固定30min，而后2%戊二醛固定2h。经标准的锇化处理和包埋后，用透射电镜进行观察。
2 实验结果
2.1 大体观察：Ⅱ期手术取出的血管支架内表面光滑、管壁有弹性、与吻合口两端正常颈总动脉的管壁结构相似。
2.2 组织学观察：标本HE染色显示，图5A、C为脱细胞处理后的组织工程血管，如图清晰可见其细胞成分已被完全脱除，细胞外基质成分保存完整，血管内弹性膜连续完整。图5B、D为经过体内移植后的组织工程血管，官腔光滑，内表面形成一层连续完整的血管内皮细胞，细胞核深染(见图5D)，外层为纤维蛋白胶与平滑细胞的混合层，纤维蛋白胶在镜下表现为均质致密的结构，内部有少量的单个平滑肌细胞，同时可见纤维蛋白胶层与血管脱细胞基质结合紧密，没有明显的分离现象(见图5B)。
2.3 电镜观察：扫描电镜下可见移植后的组织工程血管的内表面已有内皮细胞覆盖，细胞之间结合紧密，内皮细胞间显露有脱细胞基质的纤维结构(图6B)。图6A，显示了未用于移植的组织工程血管内表面疏松的三维结构。图6C，为透射电镜下紧密连接的内皮细胞结构。
3 讨论
血管组织工程研究的支架材料主要分为两大类:生物支架材料和可降解高分子聚合物材料[8]。高分子聚合物材料可以在体内完全降解，理化性质可以人为控制，生产重复性好。但聚合物材料最大的不足之处是其生物相容性差，降解产物对细胞的生物学及新组织形成有多方面的不利影响[9]。生物支架材料主要由细胞外基质成分构成， 具有增加细胞黏附及新组织形成的生物学信号， 具有良好的体内外生物相容性[10]。血管组织工程支架材料的发展趋势将会是大量自然生物材料的应用，其中血管脱细胞基质材料具有理想的形态和生物相容性，逐渐成为血管组织工程研究的重要支架材料[11]。人源性生物材料的供应不足使人的同种异体血管脱细胞基质支架材料应用受到极大的限制，由于学者们发现，一定胎龄胚胎动物的某些组织具有较低的免疫原性，所以在当今人类异种器官移植领域研究中，猪的胚胎已成为人类器官组织移植研究的首选来源。本实验中采用的孕末期胎猪主动脉脱细胞基质(DAFP)材料具有极低的异种免疫原性、适当的生物力学性质以及良好的体内外生物相容性[6]，为进一步证明该材料的体内相容性，笔者将其成功地移植入家犬的颈总动脉处，并检测出支架血管的内表面有大量连续的内皮细胞覆盖。
综上所述，本实验为异种生物材料应用于人类小口径血管组织工程研究提供崭新的思路，也为DAFP材料的临床应用研究提供理论与实践依据。
[参考文献]
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[2]Nerem RM,Seliktar D.Vascular tissue engineering[J].Annu Rev Biomed Eng,2001,3:225-243.
[3]Rieder E,Nigisch A,Dekan B,et al.Granulocyte-based immune response against decellularized or glutaraldehyde cross-linked vascular tissue[J].Biomaterials 2006,27(33):5634-5642.
[4]Martin ND,Schaner PJ,Tulenko TN,et al.In vivo behavior of decellularized veinallograft[J].Surg Res,2005,129(1):17-23.
[5]Vara DS,Salacinski HJ,Kannan RY,et al.Cardiovascular tissue engineering: state of the art[J].PatholBiol,2005,53(10):599-612.
[6]LIU Guo-feng,HE Zhi-juan,YANG Da-ping,et al ......
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