人脂肪干细胞(ADSCs)体外培养的研究及应用进展(1)
干细胞是一类具有自我更新与增殖能力的细胞，按其分化阶段不同分为胚胎干细胞与成体干细胞，目前对成体干细胞的研究较为广泛。人的脂肪干细胞(adipase derived stem cells，ADSCs)是来源于脂肪组织的干细胞，具有自我更新及多向分化的能力，在适宜诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。自从2001年ZUK[1]首次通过吸脂术抽取脂肪组织悬液培养出多能干细胞，ADSCs因其取材方便，一次取材获取的细胞数量大，对供体创伤小等优点已成为近年来种子细胞的研究热点。
1 ADSCs的获取
脂肪组织是人体中含量最丰富的组织，占正常体重的10%～29%[2]。它的存在主要有两种形式：棕色脂肪组织及白色脂肪组织。其中棕色脂肪组织仅在婴儿期发挥作用，而白色脂肪组织在人体起到储存及释放能量的调节器作用，主要分布在腹腔内的网膜、肠、肾周及臀部、大腿、腹部的皮下区域[3]。因此研究重点集中在白色脂肪组织。目前，ADSCs主要通过局部脂肪切除术及抽脂术后的脂肪组织中获取，但Vallee等[4]发现由抽脂术获得的脂肪有更好的成脂潜力、重建三维脂肪替代物能力。供者的年龄也是影响ADSCs的因素。一般来说供者的年龄越小，细胞增生能力越好，反之亦然。然而，AustL等[5]却认为ADSCs的衰老与供体的体质指数呈负相关，而与年龄无关。取材部位不同，ADSCs数量凋亡倾向也不同。Schipper等[6]发现人前臂脂肪组织中含有更多的脂肪干细胞，而腹部的ADSCs不容易凋亡；腹部似乎比臀部或大腿更有利于获取ADSCs[7]。
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2 ADSCs分离培养
2.1分离：目前常用的是酶消化法，将脂肪组织剪碎后采用胶原酶或胰酶消化、过滤离心后，使用含血清的培养基将沉淀重悬后接种于培养瓶中。沉淀物是多种细胞的混合物，又称为血管基质成分(Stromal vascular fraction，SVF)，其中含有内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、前脂肪细胞、间充质干细胞及血液来源的细胞，常需传代来纯化。
2.2 培养：体外培养需要合适的生长条件，培养基的选择很重要。常用的培养基有DMEM、a-MEM、RPMI1640。Lee等[8]报道L-DMEM比a-MEM更适合培养ADSCs。Mischen等[9]研究表明低糖更有利于维持ADSC的多分化潜能，而培养液中的抗生素对ADSC的细胞表型和分化能力无影响。Bunnell等[10]认为25%血清浓度可能使ADSC向脂肪细胞分化，而低氧低血清可增加ADSC凋亡。对于最优的糖浓度及血清浓度尚不明确。为了消除动物血清的使用带来的不良影响，部分文献开始介绍低人血清培养基或无血清培养基的使用。Dromard等[11]将ADSCs作为一种浮动的球体培养在无血清培养基中仍能维持较好的分化能力。从血小板释放的血小板源性生长因子(PDGF)-AB和转移性生长因子TGF-β1在人ADSCs及人真皮纤维细胞显示了一定的增长潜力[12]。在培养中还需要考虑到细胞接种密度、培养时间及传代次数。低密度种植可避免细胞克隆间的相互作用，可能更有利于ADSCs的培养[8]。国内朱艳霞等[13]发现ADSCs每隔14天传代可以获得更多更高质量的干细胞，ADSC增殖至25代以上仍保持干细胞表型特征及多向分化潜能。
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3 ADSCs的鉴定
ADSCs的鉴定主要依靠3个标准：①细胞形态及自我更新能力；②表面抗原分子表达；③多向分化潜能。Zuk等[1]观察到ADSCs在接种后4h开始出现贴壁，24～48h细胞生长处于停滞状态，形态呈小圆形，直径约5um；48h后细胞出现伸展，呈纤维细胞样短梭形；5～6天后细胞呈集落样生长，有克隆形成。ADSCs目前并无特异性表面标志，通常采用流式细胞仪和免疫组化来对其进行鉴别。ADSCs阳性表达CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD54、CD55、CD63、CD71、CD73、CD90、CD91、CD105、CD144、CD146、CD166等，不表达CD3、CD11b、CD14、CD19、CD31、CD38、CD45、STRO-1、CD117、CD62L、CD95L、HLA-DR等，对是否表达CD34尚存在争议[14-16]。ADSCs与间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在形态上无法区别开来，免疫表型上均共同表达CD29、CD44、CD105、CD166、CD49e，不表达CD31、CD45、HLA-DR、CD133、C-kit、Lin、CD11b[17]。不过也有发现ADSCs肯定表达CD49d，肯定不表达CD106；而MSCs与之正好相反[18]；ADSCs分化为脂肪细胞的效率更高，而MSC分化为骨和软骨的能力更高[19]。表明两者还是存在区别。另外，ADSCs分化能力可通过诱导分化为多种成熟功能细胞来证实。
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4 ADSCs的冻存
干细胞在长期培养传代易受到微生物污染、基因型改变、生理生化特性改变等情况的影响，而ADSCs在长期培养中还易自发分化，而失去多向分化能力，需要对其进行低温保存。常用细胞冻存的方法包括：①程序降温法；②过冷保存法；④玻璃化保存法[20]。低温冻存中重要因素为低温保护剂、冷却速率和复温过程[21]。樊艳等[22]通过“慢冻快融”的方法，证实成人ADSCs可以耐受短期及较长期低温冻存，复苏后ADSCs存活率较高。刘广鹏等[23]发现采用常规的细胞低温保存技术对ADSCs体外增殖及成骨能力无明显影响。不经过传统的程序冻存法，直接将ADSC悬液置于-70°冰箱贮存证明是一种可行方法[24]。
5 脂肪组织工程中的分子材料应用
无论是将干细胞分化成所需要的细胞，或有效应用于构建三维结构，特定的组织支架和信号系统都是十分必要的。支架材料可以为种子细胞提供粘附表面，模拟一定的外形，引导组织再生，便于细胞-支架重组体的操作。常见脂肪组织工程的三维支架材料有天然细胞外基质和可生物降解聚合物两种。天然的细胞外基质有胶原凝胶、透明质酸衍生物、基底胶、纤维蛋白凝胶等；可生物降解聚合物包括聚乙烯乙二醇双丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate，PEDGA)、聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)、乙醇酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)、聚乙烯对苯二酸酯(polyethylene terephthalate，PET)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)等[25]。有报道指出胶原微珠是良好的支架，它足够小用于注射且在体内能增殖、分化[26]；而植入ADSCs的透明质酸海绵的支架是稳定的细胞支架，有产生固定量组织的潜力[27]；ADSCs也能较好地在I型胶原上粘附、生长、增殖[28]；注射的PLGA球体被作为一种侵入性的软组织填充物[29]；在体外可溶因子作用下，多孔的PLGA能促进ADSC生成和成脂分化[30]；Altman等[31]描述的丝素壳多糖支架，使用该支架能增强伤口愈合及向修复组织的内皮、上皮成分转化。Melanie Vermette等[32]提出“自装配技术”的脂肪组织工程策略，该方法脱离了生物合成材料，形成的结构似乎更接近正常的皮肤结构。每种方法都各有优劣，但化学的合成物、力学稳定性及3D的体系结构对脂肪组织工程是至关重要的因素，必须确保移植后结构内细胞的渗透、有效的增殖及完全的分化[33]。, 百拇医药(徐巧瑜等)
1 ADSCs的获取
脂肪组织是人体中含量最丰富的组织，占正常体重的10%～29%[2]。它的存在主要有两种形式：棕色脂肪组织及白色脂肪组织。其中棕色脂肪组织仅在婴儿期发挥作用，而白色脂肪组织在人体起到储存及释放能量的调节器作用，主要分布在腹腔内的网膜、肠、肾周及臀部、大腿、腹部的皮下区域[3]。因此研究重点集中在白色脂肪组织。目前，ADSCs主要通过局部脂肪切除术及抽脂术后的脂肪组织中获取，但Vallee等[4]发现由抽脂术获得的脂肪有更好的成脂潜力、重建三维脂肪替代物能力。供者的年龄也是影响ADSCs的因素。一般来说供者的年龄越小，细胞增生能力越好，反之亦然。然而，AustL等[5]却认为ADSCs的衰老与供体的体质指数呈负相关，而与年龄无关。取材部位不同，ADSCs数量凋亡倾向也不同。Schipper等[6]发现人前臂脂肪组织中含有更多的脂肪干细胞，而腹部的ADSCs不容易凋亡；腹部似乎比臀部或大腿更有利于获取ADSCs[7]。
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2 ADSCs分离培养
2.1分离：目前常用的是酶消化法，将脂肪组织剪碎后采用胶原酶或胰酶消化、过滤离心后，使用含血清的培养基将沉淀重悬后接种于培养瓶中。沉淀物是多种细胞的混合物，又称为血管基质成分(Stromal vascular fraction，SVF)，其中含有内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、前脂肪细胞、间充质干细胞及血液来源的细胞，常需传代来纯化。
2.2 培养：体外培养需要合适的生长条件，培养基的选择很重要。常用的培养基有DMEM、a-MEM、RPMI1640。Lee等[8]报道L-DMEM比a-MEM更适合培养ADSCs。Mischen等[9]研究表明低糖更有利于维持ADSC的多分化潜能，而培养液中的抗生素对ADSC的细胞表型和分化能力无影响。Bunnell等[10]认为25%血清浓度可能使ADSC向脂肪细胞分化，而低氧低血清可增加ADSC凋亡。对于最优的糖浓度及血清浓度尚不明确。为了消除动物血清的使用带来的不良影响，部分文献开始介绍低人血清培养基或无血清培养基的使用。Dromard等[11]将ADSCs作为一种浮动的球体培养在无血清培养基中仍能维持较好的分化能力。从血小板释放的血小板源性生长因子(PDGF)-AB和转移性生长因子TGF-β1在人ADSCs及人真皮纤维细胞显示了一定的增长潜力[12]。在培养中还需要考虑到细胞接种密度、培养时间及传代次数。低密度种植可避免细胞克隆间的相互作用，可能更有利于ADSCs的培养[8]。国内朱艳霞等[13]发现ADSCs每隔14天传代可以获得更多更高质量的干细胞，ADSC增殖至25代以上仍保持干细胞表型特征及多向分化潜能。
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3 ADSCs的鉴定
ADSCs的鉴定主要依靠3个标准：①细胞形态及自我更新能力；②表面抗原分子表达；③多向分化潜能。Zuk等[1]观察到ADSCs在接种后4h开始出现贴壁，24～48h细胞生长处于停滞状态，形态呈小圆形，直径约5um；48h后细胞出现伸展，呈纤维细胞样短梭形；5～6天后细胞呈集落样生长，有克隆形成。ADSCs目前并无特异性表面标志，通常采用流式细胞仪和免疫组化来对其进行鉴别。ADSCs阳性表达CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD54、CD55、CD63、CD71、CD73、CD90、CD91、CD105、CD144、CD146、CD166等，不表达CD3、CD11b、CD14、CD19、CD31、CD38、CD45、STRO-1、CD117、CD62L、CD95L、HLA-DR等，对是否表达CD34尚存在争议[14-16]。ADSCs与间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在形态上无法区别开来，免疫表型上均共同表达CD29、CD44、CD105、CD166、CD49e，不表达CD31、CD45、HLA-DR、CD133、C-kit、Lin、CD11b[17]。不过也有发现ADSCs肯定表达CD49d，肯定不表达CD106；而MSCs与之正好相反[18]；ADSCs分化为脂肪细胞的效率更高，而MSC分化为骨和软骨的能力更高[19]。表明两者还是存在区别。另外，ADSCs分化能力可通过诱导分化为多种成熟功能细胞来证实。
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4 ADSCs的冻存
干细胞在长期培养传代易受到微生物污染、基因型改变、生理生化特性改变等情况的影响，而ADSCs在长期培养中还易自发分化，而失去多向分化能力，需要对其进行低温保存。常用细胞冻存的方法包括：①程序降温法；②过冷保存法；④玻璃化保存法[20]。低温冻存中重要因素为低温保护剂、冷却速率和复温过程[21]。樊艳等[22]通过“慢冻快融”的方法，证实成人ADSCs可以耐受短期及较长期低温冻存，复苏后ADSCs存活率较高。刘广鹏等[23]发现采用常规的细胞低温保存技术对ADSCs体外增殖及成骨能力无明显影响。不经过传统的程序冻存法，直接将ADSC悬液置于-70°冰箱贮存证明是一种可行方法[24]。
5 脂肪组织工程中的分子材料应用
无论是将干细胞分化成所需要的细胞，或有效应用于构建三维结构，特定的组织支架和信号系统都是十分必要的。支架材料可以为种子细胞提供粘附表面，模拟一定的外形，引导组织再生，便于细胞-支架重组体的操作。常见脂肪组织工程的三维支架材料有天然细胞外基质和可生物降解聚合物两种。天然的细胞外基质有胶原凝胶、透明质酸衍生物、基底胶、纤维蛋白凝胶等；可生物降解聚合物包括聚乙烯乙二醇双丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate，PEDGA)、聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)、乙醇酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)、聚乙烯对苯二酸酯(polyethylene terephthalate，PET)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)等[25]。有报道指出胶原微珠是良好的支架，它足够小用于注射且在体内能增殖、分化[26]；而植入ADSCs的透明质酸海绵的支架是稳定的细胞支架，有产生固定量组织的潜力[27]；ADSCs也能较好地在I型胶原上粘附、生长、增殖[28]；注射的PLGA球体被作为一种侵入性的软组织填充物[29]；在体外可溶因子作用下，多孔的PLGA能促进ADSC生成和成脂分化[30]；Altman等[31]描述的丝素壳多糖支架，使用该支架能增强伤口愈合及向修复组织的内皮、上皮成分转化。Melanie Vermette等[32]提出“自装配技术”的脂肪组织工程策略，该方法脱离了生物合成材料，形成的结构似乎更接近正常的皮肤结构。每种方法都各有优劣，但化学的合成物、力学稳定性及3D的体系结构对脂肪组织工程是至关重要的因素，必须确保移植后结构内细胞的渗透、有效的增殖及完全的分化[33]。, 百拇医药(徐巧瑜等)