平阳霉素诱导人血管瘤内皮细胞凋亡过程中PARP—1和Cyt—C的表达及意义(1)
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[摘要]目的：探讨平阳霉素诱导人血管瘤内皮细胞凋亡过程中PARP-1、Cyt-C的表达及可能机制。方法：在体外培养人血管瘤内皮细胞，设立两组：A组为平阳霉素组，其中加入平阳霉素(200μg/ml)，诱导血管瘤内皮细胞凋亡，B组为空白对照组。对两组血管瘤内皮细胞通过倒置显微镜、电镜观察其形态学变化，采用流式细胞仪检测平阳霉素诱导血管瘤内皮细胞的凋亡率。利用基因芯片技术筛选出差异表达的基因，从中选定PARP-1及Cyt-C表达基因，对其进行RT-PCR验证。结果：平阳霉素(200μg/ml)可以诱导体外培养的人血管瘤内皮细胞凋亡，加药24h后，在倒置显微镜和电镜下观察到明显的细胞凋亡的形态学改变，流式细胞仪检测凋亡率可达13.11%。空白对照组血管瘤内皮细胞倒置显微镜下观察无明显形态学变化，流式细胞仪检测凋亡率为3.56%。利用基因芯片技术筛选出两组差异基因4752个，其中2543个上调，2209个下调。应用DAVID软件对鉴定出来的差异基因进行生物信息学分析，从中选出与线粒体凋亡途径直接相关的蛋白表达基因：PARP-1、Cyt-C。对其进行RT-PCR检测得到的CT值显示：平阳霉素药物组相对于空白组PARP-1及Cyt-C蛋白基因呈高表达状态。结论：平阳霉素在体外可以通过多种途径诱导血管瘤内皮细胞发生凋亡，其中PARP-1及Cyt-C参与了线粒体途径调控的凋亡。
[关键词]血管瘤内皮细胞；凋亡；平阳霉素；PARP-1；Cyt-C
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2012)10-0-0
婴幼儿血管瘤发病率为1%～2%，尤其发生于颌面部的约占全身的60%。血管瘤一般出现在出生时或出生后10～14天，大约有40%新生儿在出生时即发现血管瘤，有两个生长高峰期，第一个高峰期为4～5月时，此期瘤体迅速增长，另一个生长高峰期为1岁左右，此期血管瘤大小达到最高峰，1～2岁时开始消退。虽然婴幼儿血管瘤的生物学行为是可自行消退的，但血管瘤的消退周期较长(10～12年)、大面积血管瘤消退后会引起局部后遗症(影响功能和美观)，且特殊部位的血管瘤可能引起严重并发症、甚至威胁生命，这些都需要积极干预治疗。
血管瘤的常规治疗方法主要有口服或局部注射糖皮质激素、X线放疗、放射性同位素注射或贴敷、抗肿瘤药物局部注射、口服γ-干扰素、激光治疗等。目前，临床上治疗血管瘤最广泛的是局部注射平阳霉素硬化治疗。但其诱导凋亡机制仍不明确。
近年来越来越多的实验研究证明，婴幼儿血管瘤其消退是内皮细胞凋亡(apoptosis)所致。多个学者研究发现增生期血管瘤组织中其细胞凋亡处于较低水平，是消退期细胞凋亡水平的5倍，并且内皮细胞占这些凋亡细胞的30%[1]。经典的细胞凋亡途径有两条，第一条是细胞外途径(细胞表面死亡受体通路)，另一条是细胞内途径(线粒体通路)。细胞外途径主要涉及Fas/FasL及Caspases，而细胞内途径主要与Bcl-2、Caspase9、Cyt-C(细胞色素C，cytochrome C)和Bax等相关。本研究旨从线粒体途径阐述平阳霉素诱导血管瘤内皮细胞凋亡作用机制。通过体外培养的人血管瘤内皮细胞加入平阳霉素诱导其凋亡，寻找参与线粒体代谢异常及凋亡相关的蛋白表达基因，并对寻找出的蛋白表达基因进行验证。从基因及亚细胞蛋白组学层面上对平阳霉素诱导血管瘤内皮细胞凋亡的分子机制进行深一步研究。为其理论研究提供新的实验依据，为血管瘤的临床治疗提供新的思路及方法。
1 材料和方法
1.1 材料：体外培养的人增殖期血管瘤内皮细胞由西安交通大学第二医院小儿外科惠赠。传代培养至第5～6代。主要仪器及试剂：BB16紫外清洁型培养箱(Heraeus美国)、DMLED型倒置显微镜(LEICA德国)、流式细胞仪(FACSCalibur美国)、RPMI-1640培养粉(含L-谷胺酰胺)(GIBCO公司)、标准胎牛血清(TMD天津)、氨苄青霉素(美国Sigma公司)、硫酸链霉素(美国Sigma公司)、胰蛋白酶(GIBCO公司)、Annexin V-FITC PI双染细胞凋亡检测试剂盒(上海美吉生物医药科技有限公司)。
1.2方法
1.2.1 倒置显微镜观察细胞形态：分为未加药物的空白对照组和加入平阳霉素(200μg/ml)药物组(平阳霉素为商品化药物)。将两组细胞放入37℃，5%CO2的培养箱中继续培养，每小时观察细胞形态一次。待药物作用于细胞24h后分别收集两组细胞。
1.2.2 电镜观察药物作用血管瘤内皮细胞凋亡：将收集到的两组细胞分别制作切片，瑞典LKB-V型超薄切片机进行超薄切片50～70nm，醋酸铀、柠檬酸铅染色后，日本日立H-600透射电子显微镜下观察、拍照。
1.2.3 流式细胞仪检测凋亡率：离心收集细胞，用4℃预冷的PBS洗涤，1000rpm，10min；用250μl结合缓冲液重悬细胞，并使其浓度为1×106低温500～1000r/min离心5min弃去染液；加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min； 400目的筛网过滤1次；上流式细胞仪检测，并用随机软件分析。
1.2.4 基因芯片技术筛选差异基因：选用基因芯片为Agilent表达谱芯片(由陕西北美基因有限公司提供) ......
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