腋臭患者ApoD表达变化及其分子机制的研究(2)
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参见附件。
1.4.7 蛋白检测(Detection of proteins)：采用碧云天的BeyoECL Plus ECL类试剂检测蛋白。压片采用专用的压片暗盒(FFC58/FFC83)进行。 用显影定影试剂盒(P0019/P0020)配制显影液和定影液，自行手工洗片。X光片选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMAT BT胶片。
1.5 免疫组化检测目的基因表达
1.5.1配制试剂
1.5.2 操作流程：脱蜡和水化；高压热修复抗原；组织切片染色；脱水、透明、封片、镜检、照相。
1.6 荧光定量PCR检测目的基因表达
1.6.1 提取高质量的RNA：因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，在实验过程中要防止RNA的降解，整个过程在冰上完成。具体步骤略
1.6.2 琼脂糖凝胶电泳RNA，分析提取RNA的质量：配制1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶；取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，确定可见28S和18S 两条明亮条带，而无DNA条带污染。
1.6.3 RNA反转录为cDNA。紫外分光光度计RNA定量。反转录体系(略)。
1.6.3.1 引物设计：由于本实验采用SYBR Green I做 Real Time PCR，引物设计满足特定的要求。由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。本研究用的看家基因为GAPDH。
1.6.3.2 引物质量检测：取0.2ml薄壁PCR管，向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10μl；加入正反向引物各0.5μl(引物浓度10μM)，向管中加入混合的cDNA各1μl。各管补加水至20μl。混匀，置于AB7500PCR仪中进行PCR反应。反应条件为：95℃ 5min；95℃15s，60℃34s，40cycles；加溶解曲线； 4℃终止反应。
设计的引物的溶解曲线见图1、2。两对引物的溶解曲线均单一，表明产物特异，可以用于下一步实验。利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况，计算表达差异， 采用2-△△CT方法分析基因表达相对变化。
2 结果
2.1 大汗腺的形态学观察：大汗腺的分泌活动有可能在机体内环境和外部因素的变化下，在活跃期和静息期之间往复循环。我们对大汗腺的形态学研究发现在腋臭标本和正常标本切片中均可以看到各种分泌时期的大汗腺，但对照组的大汗腺组织明显少于腋臭组，有的切片几乎没有。分泌活跃期的大汗腺管腔小，细胞呈柱状并且顶部凸出到管腔中央形成帽状物，有的已经脱离大汗腺游离到管腔中央(图3)。分泌静息期的大汗腺管腔大，细胞呈扁平状，没有凸出到管腔的分泌物(图4)。
2.2 ApoD、AR免疫组织化学结果：腋臭组大汗腺细胞浆内可见密集分布的棕黄色深染颗粒，ApoD的表达呈强阳性(图5)。正常对照组大汗腺细胞浆内仅见少量棕黄色浅染颗粒，ApoD表达呈弱阳性(图6)。ApoD在腋臭组大汗腺中的表达高于对照组。正常对照组中大汗腺细胞核内仅有少量棕黄色浅染颗粒，AR的表达呈弱阳性(图7)；而腋臭组大汗腺细胞中可见核内密集分布的棕黄色深染颗粒，AR的表达呈强阳性(图8)。
2.3 Real-time检测ApoD的表达差异：我们提取了10例腋臭的男性患者和4例正常对照的腋下组织标本，对其中ApoD的表达进行了检测。结果发现，4例正常对照中ApoD表达水平相对较低，而10例腋臭患者中ApoD的表达水平则比较高。腋臭患者中ApoD的平均表达水平是正常的2倍左右 (图9)。秩检验发现二者有统计学差别。
2.4 腋臭患者JNK1活化增强：对上述14例样本进行蛋白表达检测也发现类似的结果。同时，我们检测了JNK1的表达和活化情况。结果发现，JNK1表达在正常和腋臭患者之间没有显著差别，而腋臭患者中JNK1的磷酸化明显增强(图10)，表明腋臭患者中JNK1的磷酸化明显增强，提示增强的JNK1信号可能是腋臭发病的重要分子事件。
在上述研究的基础上，我们进一步探讨了抑制JNK1信号，能否减少ApoD的表达。为此，我们培养了腋臭患者的汗腺细胞。将培养的细胞铺板于6孔板后，给予JNK1抑制剂SP600125处理。结果发现，JNK1抑制剂能够有效地抑制JNK1的磷酸化和ApoD的表达水平(图11)，提示JNK1是ApoD表达增加的重要原因。
为了进一步分析JNK1调控ApoD表达究竟是发生在蛋白水平，还是RNA水平。我们又进一步分析了ApoD的RNA表达水平。RT-PCR检测发现，JNK1抑制剂同样能够有效抑制ApoD的RNA表达水平(图12)。表明JNK1是通过调控ApoD的转录影响ApoD的表达的。
先前的研究发现，AR可以调控JNK1的活化；而JNK1同样可以促进AR的转录活性。为此，我们进一步探讨了AR信号是否通过影响JNK1的活化调控ApoD的表达，还是其他信号引起JNK1活化，后者引起AR转录活性增强，进而引起ApoD表达增强。培养正常人汗腺细胞后，给予10-7M、10-6M的5α-DHT刺激。24h 5α-DHT刺激，浓度依赖的增强ApoD的表达，而JNK1则能一定程度的抑制ApoD的表达增加 (图13)。所有这些证据提示AR信号可以以JNK1依赖和非依赖两种方式调控ApoD的表达。
在RNA水平，我们观察到类似的现象(图14)。5α-DHT浓度依赖的增强ApoD的mRNA水平，而JNK1则能一定程度的抑制ApoD的表达增加。
3 讨论
腋臭是一种常见病，汉族人的发病率是4.56%[1]，有家族遗传性[2]。该病的确切发病机制尚不明确，近年来的研究[3]认为与大汗腺分泌功能异常有关，大汗腺细胞在腋臭发生中起重要的作用。已有研究[4]证明大汗腺分泌物气味结合蛋白(aprocrine secretion odor-binding protein， ASOB)与腋臭重要气味分子E-3-甲基-2-已烯酸(E-3-methyl-2- hexenoic acid E-3M2H)的分泌相关 ......
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